《细胞培养基本技术》PPT课件

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1、细胞培养基本技术徐州医学院神经生物研究中心王婷细胞培养的基本概念体外培养细胞培养：使用单个细胞悬液组织培养：使用组织块（0.5～1立方毫米）或薄片（厚0.2毫米）器官培养：使用器官原基或器官的一部分或整个器官培养细胞的生命归宿原代培养期传代期衰退期培养细胞的特性培养细胞的生长方式贴附生长：必须贴附于支持物表面才能生长。悬浮生长：于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。每代贴附生长细胞的生长过程游离期贴壁期潜伏期对数生长期停止期（平台期）游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态。也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。10分钟一4小时贴壁期：细胞附着于底物上，游离期结束。细胞株平均在10

2、分钟-4小时贴壁。底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子附着。进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）潜伏期此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～24小时。对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂机制：接触抑制、密度依赖性培养细胞生长的条件1.细胞的营养需要2.细胞的生存环境温度:37℃O2CO2:5%CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO

3、3-pH:7.2-7.4渗透压3.无污染4.无毒实验准备实验用品：仪器：超净工作台压力蒸汽消毒器电热干燥箱CO2培养箱倒置显微镜自动双重纯水蒸馏器纯水仪离心机天平水浴箱液氮罐冰箱酸度计滤器酸缸耗材：培养瓶吸管电动吸引器培养板冻存管等超净台超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气通过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。滤器CO2培养箱CO2培养箱设定的条件为37℃，5％CO2。使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。②保持培养箱内空气干净。定期消毒（75%酒精擦拭)。③箱内放置蒸馏水于

4、蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。自动双重纯水蒸馏器纯水仪培养板培养瓶清洗与消毒清洗玻璃器皿：新：浸泡刷洗浸酸冲洗旧：用后立即浸入水中，及时冲洗。胶塞：2%NaOH煮沸10-20min冲洗1%稀盐酸30min冲洗塑料器皿：2%NaOH浸泡过夜冲洗5%稀盐酸30min冲洗包装：牛皮纸、棉布、铝饭盒消毒紫外线消毒:湿热消毒(高压蒸汽消毒):滤过消毒:大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采化学消毒:新洁尔灭、75％酒精细胞培养用液及配制水：新鲜配置的双蒸水或去离子水平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液PBS：NaCl8.0gKCl0.2gNa2HPO4.H2O1.56gKH

5、2PO40.20加水至1000ml消化液：1.胰蛋白酶胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制。用滤器过滤除菌。2.EDTA化学螯合剂对细胞有一定离解作用3.胶原酶消化作用温和，对细胞损伤小。培养基培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。天然培养基：天然培养基有血清、血浆、组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好缺点：来源受限成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析易发生支原体污染合成培养基合成培养基是

6、根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如M199、MEM、RPMI-1640、DMEM、F12等。合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。优点：标准化生产，组分和含量相对固定，成本低。缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。血清中含有：①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）②多种金属离子③激素④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等⑤各种生长因子⑥转移蛋白⑦不明成分对于血清支持细胞生长的生物学效应已得到证明，

7、但对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚．血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要用无血清培养基培养细胞．无血清培养基的主要研制策略：在基础培养基中补充各种必需因子，如激素、生长因子、结合蛋白、贴壁和扩展因子等。无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充