细胞培养的基本方法.ppt

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1、细胞培养的基本方法细胞培养的污染和检测细胞培养中常用的染色方法培养细胞的观察ACB目录培养细胞的观察无论是研究体外细胞的增殖生长状态还是生物学性状，都需要对其进行观察和检测，其内容涉及形态生物学、细胞生物学、遗传学、生理生化、分子生物学等多学科的技术手段。这里主要介绍观察检测体外培养物最常用的技术方法。相差显微镜相差显微镜是荷兰科学家Zernike于1935年发明的，用于观察未染色标本的显微镜。活细胞和未染色的生物标本，因细胞各部细微结构的折射率和厚度的不同，光波通过时，波长和振幅并不发生变化，仅相位发生变化（x相位差），这种相位差人眼无法观察。而相差显微镜通过改变这种相位差

2、，并利用光的衍射和干涉现象，把相差变为振幅差来观察活细胞和未染色的标本。相差显微镜和普通显微镜的区别是：用环状光阑代替可变光阑，用带相板的物镜代替普通物镜，并带有一个合轴用的望远镜。一、相差显微镜观察：能增强结构之间的反差1、主要装置（1）环装光栅不同倍数的相差物镜要用相应的环状光阑（2）相板相差板上上装有吸收膜及推迟相位的相位膜（3）中心望远镜辅助望远镜培养细胞的观察培养细胞的观察2、观察活细胞的方法将相差装置与倒置光装置结合起来而制造的倒置相差显微镜广泛用于观察生长在瓶皿底面的细胞。培养细胞的观察3、相差物镜的选择与使用正（暗,即标本比周围环境暗）反差适用于物体细微结构和

3、形态、计数、运动的观察。PL（低亮，视场平坦型物镜）相差物镜常用于折射率比较弱的物体，PLL（低低亮，长工作距离平场物镜）则适用于折射强的物体。负（明，即标本比周围环境亮）反差适用于物体形态、计数和物体运动的观察，物体折射率比较弱是采用NM（中负）相差物镜，折射率比较强时采用NH（高负）相差物镜。培养细胞的观察4、相差显微镜使用注意事项1）当换不同倍率的物镜时，要选用一致的相板和相环，并重新调中，否则成像效果不佳；2）载物片或培养瓶的表面要平整、均匀、干净，标本不能太厚，以免影响观测效果；3）标本要在有水的环境中（如培养瓶的培养液、水封片等）成像效果才明显；4）光路最好加单色

4、（如黄绿色）滤光片以提高相差显微镜的分辨率。培养细胞的观察二、细胞计数法1、细胞计数法是利用血细胞计数板计数细胞悬液中的细胞数目，以测定细胞增殖和调整细胞浓度的一种方法。2、细胞生长曲线是观察细胞在一代生存期内的增生过程的重要指标。只有具备自身稳定生长特性的细胞才适合在观察细胞生长变化的实验中应用。培养细胞的观察3、细胞分裂指数是指分裂期细胞在全部细胞中所占的百分率，用以表示细胞的增殖旺盛程度。一般取1000个细胞中的细胞分裂相数。4、细胞贴壁率又称接种存活率，用于观察贴壁附着生长细胞，主要反映细胞的生存能力（只有活细胞才贴壁）和部分底物材料的生物相容性。培养细胞的观察5、细

5、胞周期这里的细胞周期仅指一个细胞的分裂生长周期时间，而不是指细胞群体倍增时间。可利用培养细胞来研究细胞动力学、DNA合成代谢和有丝分裂。细胞周期的时间测定有两种方法。（1）同位素标记测定法（2）流式细胞仪测定法6、MTT(二甲基噻唑二苯基四唑溴盐）比色法测定细胞活力。细胞培养中常用的染色方法-活体染色一、活体染色体外活体染色就是在体外条件下用某种活体染料对活的组织或细胞进行染色，而不影响活细胞的生命活动的一种方法。1、活体染料的类别可分为碱性和酸性活体染料两大类。碱性：噻嗪类（次甲基蓝、甲苯胶蓝），亚喷类（亮焦油蓝、亮焦油紫），吖嗪类（中性红、詹纳斯绿），三酚苯甲烷类（甲基紫

6、、维克多利亚蓝）。酸性：台盼蓝、刚果红、吡咯蓝。体外活体染色一般用碱性活体染料，酸性活体染料只用于体内活体染色。细胞培养中常用的染色方法-活体染色2、活体染色方法（1）台盼蓝染色1）用Hank’s液（最常用的无机盐溶液和平衡盐溶液，主要用于洗涤细胞和组织的，也是合成培养基的基础液。如果含有钙镁离子的话，当用消化液消化细胞时，钙镁离子会破坏消化液的活力。）配制0.1%台盼蓝溶液；2）用0.5%的胰蛋白酶：0.2%EDTA=1:1混合液消化培养的贴壁细胞；3）加入适量Hank’s液制成细胞悬液；4）每毫升细胞悬液加入10μl0.1%台盼蓝溶液，混匀；5）用毛细吸管吸少许混合液置细

7、胞计数板，并在显微镜下计数；6）计数1000个细胞中的活细胞（折光性强且不着色）和死细胞（染上蓝色）数目。细胞培养中常用的染色方法-活体染色细胞培养中常用的染色方法-活体染色（2）吖啶橙荧光染色法吖啶橙用于直接染色观察活细胞或固定染色观察细胞。与DNA结合呈亮绿色，与RNA结合呈橘红色至火红色。细胞培养中常用的染色方法-活体染色吖啶橙/溴化乙锭双荧光染色细胞培养中常用的染色方法-染料排除检测法二、染料排除检测法由于死细胞的细胞膜通透性发生改变，某些染料可大量进入却不被排出，因而细胞显示一定颜色。而活细胞