动物细胞培养的基本方法

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1、第五节动物细胞培养的基本方法一细胞分离1离心分离法用于从含有细胞的体液如血液、羊水、胸腹水中分离细胞。一般用800～1000rpm离心5～10min。2消化分离法先从生物体取来组织块，将其剪碎，并用消化液将其消化，使组织松散成细胞悬液，然后用缓冲液洗涤、离心、去除残留的消化液而获得所需的细胞。常用的消化液有胰蛋白酶、乙二胺四乙酸、胰酶－柠檬酸盐、胰酶－EDTA、胶原酶、链霉蛋白酶、木瓜蛋白酶等。二细胞计数1血球计数板计数2自动细胞计数器计数3结晶紫染色细胞核计数法4MTT染色计数法三细胞传代1悬浮细胞的传代加入一倍或几倍的生长液，然后分种两只或多只培养瓶即可。2

2、贴壁细胞的传代消化前需用肉眼或镜下观察需消化的细胞，确认细胞有无污染；加入消化液量要适当，以摇动时能盖满单层细胞为度；消化时间不宜过久，一般在室温下静置2～5min,当见细胞层出现麻布样网孔时，即可倒去消化液。终止消化要先倒去消化液，然后加入有血清的培养基。已培养过的瓶子可再次使用，但一般不要超过2～3次。2倍体细胞培养时每次传代必须写上传代次数。分种数量取决于细胞数和细胞特性，多数细胞分种以20～30万个/ml,每次1传2或1传3。传代后一般每天或隔一天换液，每3～5天就要传代一次。四细胞的冻存和复苏将细胞放入试管内，在冰浴条件下加入预冷的冰冻保护剂（二甲基亚

3、砜+山梨醇+甘油+蔗糖）。密封试管，继续在冰浴中停留15min。然后试管以1℃/min的速度冷却，降到-40℃，在-40℃停留2h后投入液氮罐（-196℃）。1细胞的冻存2细胞的复苏复温速率复温速率是指在细胞复苏时温度升高的速度。一般来说复苏速度越快越好。常规的做法是，在37℃水浴中，于1～2min内完成复温。第六节动物细胞大量培养的方法和操作方式动物细胞大规模培养：在人工条件下（设定pH、温度、溶氧等），在细胞生物反应器（bioreactor）中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。目前可大规模培养的动物细胞有鸡胚、猪肾、猴肾、地鼠肾等多种原代细胞及人

4、二倍体细胞、cho（中华仓鼠卵巢）细胞、BHK-21(仓鼠肾细胞)、Vero细胞(非洲绿猴肾传代细胞，贴壁依赖)等。已成功生产了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、红细胞生成素、单克隆抗体等产品。依细胞种类：原代培养、传代培养依培养基：液体培养、固体培养依培养器和方式:静止培养、旋转培养、搅拌培养、微载体培养、中空纤维培养、固定床或流化床培养。生产实际来看：悬浮培养、贴壁培养和贴壁-悬浮培养。一、动物细胞大规模培养的方法1、悬浮培养（suspensionculture）让细胞自由的悬浮于培养基内进行生长繁殖。适用细胞类型：悬浮细胞，兼性贴壁细

5、胞，杂交瘤设备：通气搅拌式生物反应器、气升式生物反应器。生产药物：单克隆抗体；干扰素。缺点：细胞体积小，且处于悬浮状态，难采用灌流培养，细胞密度低。优点：操作简单，培养条件均一，传质和传氧效果好，容易大规模培养。借鉴微生物发酵理论和经验，发挥动物细胞的特性。2、贴壁培养必须让细胞贴附在某种基质上生长繁殖的培养方法。适用细胞类型：贴壁依赖型细胞，兼性贴壁细胞。基质要求：具有净阳电荷和高度表面活性。对微载体而言还要求具有一定电荷密度。优点：a容易更换培养液，细胞紧密黏附于固相表面，可直接倾去旧培养液，清洗后直接加入新培养液。b容易采用灌流培养，从而达到提高细胞密度的

6、目的，因细胞被固定，不需过滤系统。c当细胞贴壁于生长基质时，很多细胞将更有效的表达一种产品。缺点：a操作比较麻烦，需要合适的贴附材料和足够的面积。b培养条件不易均一，传质和传氧效果差。c不能有效地监控细胞的生长。贴壁培养系统：中空纤维；玻璃珠；微载体培养。贴壁培养和悬浮培养的不同之处是在传代或扩大培养时，常常需要用酶将其从基质上消化下来。3、贴壁-悬浮培养，或称假悬浮培养将悬浮培养和贴壁培养相结合的方法。①微载体培养：细胞贴附在载体表面。创造大的贴附面积，供细胞贴附生长增殖；载体体积小，比重较轻，在轻度搅拌下即可携带细胞自由地悬浮在培养基内，充分发挥悬浮培养的一

7、切优点。载体：葡聚糖、聚苯乙烯、胶原等。理想的微载体应具备：生物相容性；无毒性；表面惰性；比重适当（1.030-1.045g/ml）；粒径均一，在60-250m之间（溶胀后）；光学透明；柔软；耐高压灭菌温度；反复多次使用；制备简单、原料充分。80年代以后发展的多孔微载体或多孔微球，增大了供细胞贴附的比表面积。应用：工业化生产干扰素、疫苗和尿激酶原②包埋或微囊培养：将细胞包埋或包裹在凝胶载体或微囊内。可用于包埋细胞的载体材料为：人工合成的高分子聚合物；糖类如纤维素等；蛋白质如胶原、纤维蛋白等。包埋法：将细胞包埋在多孔载体内部制成固定化细胞的方法。优点：步骤简单，

8、条件温和，负荷量大，细胞