细胞培养的基本方法

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1、第三章细胞培养的基本方法第一节无菌操作技术第二节培养细胞的观察第三节细胞培养中常用的染色方法第四节细胞培养的污染和检测主要内容教学目的和要求重点和难点：掌握细胞培养中无菌操作技术及操作过程中需要注意哪些问题；预防污染是无菌操作的关键。由于体外培养的细胞没有抗感染能力，因此防污染是决定培养成功的首要条件。即便使用设备完善的实验室，若实验者粗心大意，技术操作不规范,也会导致污染。一切操作需要保证无菌和有条不紊。组织培养中最重要的，也是最基本的要求就是各项操作均应从无毒害、无污染的培养环境来考虑。培养基、器皿材料、接种工具、操作环境、培养室和超净工作台等各个环节都应注意。第一节无菌操作技术一、实验

2、器具等的洗涤和材料的准备在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。有关数据的计算要事先做好。根据实验要求，准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放置操作场所(培养室、超净台)内，然后开始消毒。这可以避免开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污染机会。培养玻璃器具的洗涤是非常重要的。用完后应洗净，再用蒸馏水冲一遍，烘干；用合适的方法灭菌。二、培养室和超净台的消毒（一）、无菌与有菌范畴灭菌工作是极其重要的。对于初学者来说，首先应建立有菌和无菌的概念。有菌的范畴：凡是暴露在空气中的物体，至少其表面都是有菌的。如植物表面、超净工作台的台面，未处理的工具、手等。无菌的范畴：物理或化学处理的物体（工具、器皿、

3、培养基等）健康的动植物不与外部表面接触的组织内部可能是无菌的（有时也有内生菌，但不会影响培养，也不会污染）经过灭菌的物品有可能再次染菌（二）无菌操作室工作前后室内清扫、拖地，以防菌在空气中流动，特别真菌孢子。使用前，室内及超净工作台紫外灯杀菌30分钟，超净工作台酒精（75%）杀菌，工作中一直吹风。三、洗手和着装原则上和外科手术相同。平时仅做观察不做培养操作时，可穿着细胞培养室内紫外线照射30min的清洁工作服。在利用超净台工作时，因整个前臂要伸入箱内，应着长袖的清洁工作服，并于开始操作前要用75％酒精消毒手。如果实验过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。进入培养室需彻底洗

4、手还要戴口罩、着消毒衣帽。无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面—次(拖布要专用)，紫外线照射消毒30-50min，超净工作台台面每次实验前要用75％酒精擦洗。然后紫外线消毒30min。在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线，消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置，否则会遮挡射线降低消毒效果。—些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。四、无菌培养操作1、首先点燃酒精灯，所有操作均在火焰近处并经过烧灼进行；冷却后才能使用；2、操作时，打开试管盖，要进行烧灼灭菌，但是时间要短。在火焰上烧瓶口。保证容器倾斜。3、进行操作时动作要准

5、确敏捷，但是不宜太快，防止空气流动，增加污染的机会；4、超净工作台上的器具和用品要摆放合理；5、操作时器具不能触及瓶口以防止污染；6、不要说话、咳嗽、打喷嚏等，头发、首饰等注意；7、吸管、注射器等专管专用。接种时在近火焰处打开瓶口，使瓶倾斜，以免空气中微生物落入瓶中正确错误整个接种操作应在近火焰处进行，且动作要迅速正确错误防止操作带来的污染接种过程中尽可能达到悬空要求正确错误正确错误接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口瓶盖朝上放，接种完毕后立即盖好瓶口正确错误接种完一瓶用火烧用具以防止交叉污染产生种子和分生组织：培养时通常将其贴放在培养基表面，而不是插到培养基内部，以免供氧不足正确错误接种茎段：注

6、意形态学下端插入培养基内，而形态学上端露于空气中正确错误污染材料应及时清除，高压灭菌。菌有两种，细菌成粘液状，真菌有菌丝。特别真菌危害极大。五、使用超净台注意事项1、超净台安装在清洁无尘的房间内，最好为隔离的无菌间，以免尘土过多易使滤器阻塞，降低净化效果，缩短使用寿命；2、长期未使用或新安装的超净台使用前必须对工作台和周围环境进行清扫，再采用化学灭菌或紫外线灭菌法进行灭菌处理；3、使用前用75％酒精擦洗台面，并提前用紫外线灭菌30min。关闭紫外灯后应启动鼓风机运转几分钟后再进行培养操作；4、净化工作区不应存放不必要的物品，以保持洁净气流型不受干扰；5、用后工作台要用75％酒精擦洗，以备后面工

7、作人员使用；6、经常注意工作区上方微压表的指示，及时更换滤器。六、培养细胞的取材取材组织用培养液浸泡，4度运送，24h内尽快培养。取材无菌操作，避免对组织的机械损伤，尽量去除脂肪、神经、结缔、坏死组织，污染组织可用青链霉素和制霉菌素漂洗。原代取材同时保留组织学和电镜标本，对供体来源、部位及一般情况做记录。欲从组织中获得大量生长良好的细胞，须将组织分散开，使细胞解离出来。常用方法有机械法和化学法。第