第2章 细胞培养的设备和基本方法.ppt

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1、第二章细胞培养的设备和基本方法实验室及设备★培养基制备室烘箱冰箱天平灭菌锅★无菌操作室超净工作台（生物安全柜）★培养室光照培养室暗培养室摇床★显微工作室倒置显微镜器皿的选择与清洗最常用：不同规格三角瓶清洗：自来水洗，烘干泡酸自来水洗去离子水洗三蒸水洗烘干新瓶子均按该程序清洗，培养材料染菌的瓶子经高压灭菌后也按该程序清洗。酸液（洗液）：浓硫酸加重铬酸钾培养基母液的配制1基本培养基：不含激素的培养基母液：浓缩液※大量元素母液：通常配成10×浓缩液，配1L培养基时加100mL注意：配制时加一个溶解一个，最后加钙※微量元素母液：通常配成1000×浓缩液，配1L培养基时加1mL※铁盐母液：通常配成1

2、00×浓缩液，配1L培养基时加10mL螯合铁使得培养基pH升高至6～8时，铁离子仍保持二价，可被很好地吸收利用培养基母液的配制2※有机物母液（维生素与氨基酸）：通常配成100×浓缩液，配1L培养基时加10mL※植物激素母液：通常配成0.1mg/mL浓缩液，配1L培养基时加xmL◆常用生长素：2,4-D,NAA配制时先用少量0.1mol/LNaOH溶解◆常用细胞分裂素：6-BA,KT配制时先用少量1mol/LHCl溶解注：母液配好后，注明名称、浓度、配制时间，4℃冰箱保存培养基的配制程序1、按照配方，精密量取准确体积的大量元素、微量元素、铁盐、有机物、激素母液于干净烧杯中2、加入蔗糖（通常用

3、量30g/L)，溶解定容。3、调pH=5.8NaOH和HCL调如果是固体培养基，在调好pH后加入琼脂（通常用量7g/L)，加热溶解后分装。4、分装，封口，标记。5、高压灭菌：115℃，15min。过滤消毒高压灭菌会破坏活性，有些物质需要进行过滤消毒加入到培养基：0.45或0.22μm微孔滤膜进行过滤。如激素、诱导子等。材料器械的消毒与无菌操作植物材料的消毒在充分清洗后（通常流水冲洗几小时），复合灭菌：75％酒精灭菌0.5min，0.1%升汞灭菌5～20min。消毒效果非常好。消毒剂灭菌后一定要用无菌水充分清洗。器械的消毒玻璃器具高温灭菌：121℃，30min塑料枪头、枪头盒子、滤膜等：11

4、5℃，15min灭菌后烘箱内烘干75％酒精消毒后拿入安全柜，部分进行火焰灭菌。灭菌方法1、高压灭菌2、干热灭菌3、过滤灭菌4、药剂灭菌5、火焰灭菌6、熏蒸灭菌：KMnO4+HCHO实验室灭菌7、紫外灭菌：无菌间及安全柜灭菌超净工作台的使用原理：过滤除菌通风每次操作前紫外灭菌30min！！注意：实验前记得关紫外灯开启后通风10min左右再操作细胞计量技术细胞计数血球计数板－动物细胞工程详细讲解细胞体积测量细胞鲜重和干重减压抽滤后测得细胞鲜重（FCW），烘箱内烘至恒重，测得细胞干重（DCW）有丝分裂指数一个细胞群体中，处于有丝分裂的细胞占总细胞的百分数。衡量同步分裂的最好指标。植板率平板法培养

5、单细胞或原生质体时，细胞形成细胞团的频率＝（平板上的细胞团数/平板上接种的细胞数）×100植物激素调控离体细胞的器官与胚胎发生PlanthormonesPlantgrowthregulators激素的合理运用是植物细胞工程研究重要的基本方法：器官分化和植株再生；获得最大细胞生物量和次生代谢物产量生长素和细胞分裂素生长素：组培中生长素添加为了促进离体细胞分裂形成愈伤组织，或诱导试管苗生根强度：2,4-D、NAA、IAA的强度比100:10:12,4-D：2,4-dichlorophenoxyaceticacid2,4-二氯苯氧乙酸细胞分裂素：组培中分裂素添加能诱导离体培养的芽形成丛生芽，诱

6、导离体组织的细胞增殖，再生不定芽。激动素（KT,kinetin）人工合成6-BA(6-Benzyladenine)另外三种植物激素赤霉素组培中GA3用于诱导离体芽的萌动和伸长乙烯最普遍的功能是加速果实的成熟和组织的老化。乙烯对组织培养物的生长、胚胎发生或芽的形成产生抑制作用，因此通过降低培养基中蔗糖的浓度，或用麦芽糖和葡萄糖代替蔗糖来抑制乙烯的产生。脱落酸组培中主要用于胚胎或胚状体发育的后期，抑制胚胎的过早萌发，促进胚胎成熟，使胚胎长成形态正常的植株生长素和细胞分裂素的协同作用较高浓度的生长素单独或与细胞分裂素结合使用可有效刺激培养细胞的增殖和连续生长，形成愈伤组织。培养基中KT浓度高于I

7、AA浓度时，培养物形成芽，不形成根；两者浓度大致相等时，只诱导愈伤组织发生，基本没有器官发生；当IAA浓度高于KT时，培养物分化出根，不形成芽。这种KT和IAA浓度比例效应，适合于许多双子叶植物的组培。其它类生长素和分裂素结合使用，效应相类似。但并非绝对。禾谷类植物的情况有所不同2,4-D或2,4,5-T单独作用即可诱导禾谷类植物的幼嫩组织（幼胚和幼穗）产生愈伤。其愈伤在低浓度生长素单独作用下，即可实现离体器官发生或胚胎