细胞培养基本技术和操作方法

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1、细胞培养基本技术实验概要无菌操作基本技术1.实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminarflow)以紫外灯照射30-60分钟灭菌，以70%ethanol擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70%ethanol擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。2.无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管

2、盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70%ethanol擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。3.小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。4.工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少ClassII)。

3、操作过程中，应避免引起aerosol之产生，小心毒性药品，例如DMSO及TPA等，并避免尖锐针头之伤害等。5.定期检测下列项目：a:CO2钢瓶之CO2压力b:CO2培养箱之CO2浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。c:无菌操作台内之airflow压力，定期更换紫外线灯管及HEPA过滤膜，预滤网(300小时/预滤网，3000小时/HEPA)。6.水槽可添加消毒剂(Zephrin1:750)，定期更换水槽的水。实验原理主要试剂培养基1.液体培养基贮存于4oC冰箱，避免光照，实验进行前放在37oC水槽中温

4、热。2.液体培养基(加血清)存放期为六个月，期间glutamine可能会分解，若细胞生长不佳，可以再添加适量glutamine。3.粉末培养基配制(以1升为例)：细胞培养基通常须添加10%血清，因此粉末培养基之配制体积为900ml，pH为7.2-7.4。NaHCO3为另外添加，若将NaHCO3粉末直接加入液体培养基中会造成pH之误差，或局部过碱。因此粉末培养基及NaHCO3粉末应分别溶解后才混合，然后用CO2气体调整pH，而非用强酸(HCl)或强碱(NaOH)，因为氯离子对细胞生长可能有影响，且贮存时培养基的pH易发生改变

5、。材料：a:纯水(milli-Q水或二次至三次蒸馏水，水品质非常重要)b:粉末培养基c:NaHCO3(SigmaS-4019)d:电磁搅拌器e:无菌血清瓶f:0.1或0.2mm无菌过滤膜g:pHmeterh:真空帮浦i:CO2气体步骤：a:取粉末培养基溶于700mlmilli-Q水中，搅拌使其溶解。b:称取适量之NaHCO3粉末(数量依培养基种类而异)溶于200mlmilli-Q水中，搅拌使其溶解，然后通入CO2气体至饱和，约3-5分钟。c:将溶解且含饱和CO2之NaHCO3溶液加入溶解之液体培养基中混合。混后溶液之pH应

6、为7.2-7.4，除非pH值偏差太大，否则不需用酸碱再调整之。若为太碱，可再通入CO2气体调整pH。培养基以真空帮浦通过过滤膜时，pH会升高0.1-0.2。3.3.4.以0.1或0.2mm无菌过滤膜过滤灭菌，同时分装至无菌容器中，标示培养基种类、日期、瓶号等，贮存于4oC。(血清亦可加入培养基中一起过滤)d:配制之培养基配制须作生长试验与污染测试。4.配制培养基之生长测试材料：a:MDCKcell(ATCCCCL-34或CCRC60004)b:6-wellTCplate(or35mmTCdish)c:methanold:g

7、lacialaceticacide:10%Giemsasolution(GibcoBRL10092-013)主要设备实验材料实验步骤1.材料：1.1.细胞培养实验用品均为无菌，除了玻璃容器与pasteurpipet外，其它均为塑料无菌制品。1.2.TC级培养盘表面均有coating高分子物质以让细胞吸附，培养容器种类有Tflask,plates,dishes,rollerbottle等，依实验需要使用。1.3.plasticsterilepipet:1ml,2ml,5ml,10ml,25ml1.4.塑料离心管:15ml,5

8、0ml，均有2种不同材质，其中polypropylene(PP)为不透明材质，polystyrene(PS)为透明材质，可依实验需要而选择适合材质之离心管。1.5.glasspastuerpipet:9inch，用以抽掉废弃培养液等。1.6.玻璃血清瓶(PyrexorDuranglassware)：10