细胞培养的基本技术.pdf

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1、细胞培养基本技术ustcwhm@ustc.edu.cnhttp://biox.ustc.edu.cn→科研实验室→免疫学研究所→PPT下载1无菌操作技术体外培养细胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。即便使用设备完善的实验室，若实验者粗心大意，技术操作不规范,也会导致污染。因而,为在一切操作中最大可能地保证无菌，每一项工作都必须做到有条不紊和完全可靠。2Termstoremember:Termstoremember消毒(disinfection)和消毒剂(disinfectant)灭菌(sterilization)防腐(antisep

2、sis)和防腐剂抑菌(bacteriostasis)和抑菌剂(bacteriostatic)无菌(asepsis)无菌技术/无菌操作(antiseptictechnique)3无菌操作技术1.工作环境及表面的处理2.细胞培养所用玻璃及塑料制品的处理3.实验者的操作技术4.培养液的处理4无菌技术概念无菌技术无菌区是指在医疗、护理操是指在医疗、护理操是指经过灭菌处理是指经过灭菌处理作过程中，防止一切作过程中，防止一切是指未经过灭菌处理是指未经过灭菌处理是指无菌物品自无菌是指无菌物品自无菌非无菌区且未被污染的区域。，或虽经过灭菌处理且未被污染的区域。，或虽经

3、过灭菌处理是指经过物理或化学是指经过物理或化学是指未经处理或消毒是指未经处理或消毒微生物侵入人体和防微生物侵入人体和防容器内一经取出，就容器内一经取出，就方法灭菌后保持无菌方法灭菌后保持无菌相对无菌区止无菌物品、无菌区止无菌物品、无菌区但又被污染的区域。但又被污染的区域。认为是相对无菌，不认为是相对无菌，不灭菌后又被碰脏的物灭菌后又被碰脏的物状态的物品。状态的物品。无菌物品域被污染的技术。域被污染的技术。品。品。可再放回。可再放回。无菌区边缘向内无菌区边缘向内3cm3cm污染物品为相对无菌区。为相对无菌区。5【培养前准备】在开始实验前要制定好实验计划和

4、操作程序。有关数据的计算要事先做好。根据实验要求，准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放置操作场所(培养室、超净台)内，然后开始消毒。这可以避免开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污染机会。6【操作野消毒】无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面—次(拖布要专用)，紫外线照射消毒30-50min，超净工作台台面每次实验前要用75％酒精擦洗。然后紫外线消毒30min。在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线，消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置，否则会遮挡射线降低消毒效果。—些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后

5、置于台内同时紫外线消毒。7【洗手和着装】原则上和外科手术相同。平时仅做观察不做培养操作时，可穿着细胞培养室内紫外线照射30min的清洁工作服。在利用超净台工作时，因整个前臂要伸入箱内，应着长袖的清洁工作服，并于开始操作前要用75％酒精消毒手。如果实验过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。进入原代培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。891011【火焰消毒】在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要点燃酒精灯。以后一切操作，如按装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。培养瓶试管培养皿滴管吸管12【操作】进行培养时，动

6、作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。接种环、接种针L形涂布棒13培养细胞的观察１．肉眼观察培养物颜色及混浊度14体外培养细胞的常见问题15161718２．倒置显微镜观察细胞生长状态19体外培养细胞的方式群体培养（massculture），将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合（confluence）后形成均匀的单细胞层；克隆培养（clonalculture），将高度稀释的游离细胞悬液加入培养瓶中，各个细胞贴壁后，彼此距离较远，经过生长增殖每一个细胞形成一个

7、细胞集落，称为克隆（clone）。一个细胞克隆中的所有细胞均来源于同一个祖先细胞。20群体培养（左）和克隆培养（右）21体外培养细胞的分型（一）贴附型：大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞，判断细胞形态时不能按照体内组织学标推判定，仅大致分成以下四型：221、成纤维细胞型：胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织，如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等常呈本型状态。另外，凡培养中细胞的形态与成纤维类似时皆可称之为成纤维细胞。23名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的来源：由中胚层

8、间充质组织起源的组织如：真正的成纤维细胞，心肌，平滑