细胞培养的基本技术黄建华

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1、第四章细胞培养的基本技术解放军总医院基础医学研究所免疫学研究室黄建华细胞培养技术平台基因治疗基因诊断试管婴儿组织工程药物筛选致病机理主要内容基本操作技术和要求原代培养传代培养和细胞系的维持细胞冻存与复苏细胞培养污染的检测和排除细胞是生命活动的基本单位1665年英国学者RobertHooke，用自制的显微镜观察软木的薄片，第一次发现植物的细胞结构，并首次借用拉丁文Cella（小室）词.1983-39德国植物学家施莱登和动物学家施旺确立了“细胞学说”的基本原则。（１）细胞是有机体，动植物都是由细胞发育来的；（２）每个细胞都作为一个相对的独立单位，有自己的“生命”。（３）新的细胞可以通过老的细胞繁殖

2、产生。进化论，遗传学和细胞学说定为现代生物学的三大基石，而细胞学说又是后二者的"基石"。组织（细胞）培养从生物体内取出细胞（组织），模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存、生长并维持其结构和功能的方法。细胞（组织），包括器官培养终归是离体培养，缺少生物整体的严密联系，不能代表整个机体。在进行医学生物实验过程及对结果的评估是都必须考虑这些。1基本操作技术和要求由于体外培养的细胞没有抗感染能力，因此防污染是决定培养成功的首要条件。一切操作需要保证无菌和有条不紊。1.1培养室内的无菌技术培养前的准备：按实验计划和程序准备物品，作到心中有数培养室和超净台：定期全面彻底消毒培养用品

3、的无菌处理：高压灭菌、过滤、酒精消毒实验中无菌培养操作：均在火焰近处进行，实验用品需火焰灭菌，冷却后接触培养细胞，以防烧死细胞。1.2培养细胞的取材基本要求：取材组织用培养液浸泡，4度运送，24h内尽快培养。取材无菌操作，避免对组织的机械损伤，尽量去除脂肪、神经、结缔、坏死组织，污染组织可用青链霉素和制霉菌素漂洗。原代取材同时保留组织学和电镜标本，对供体来源、部位及一般情况做记录。1.2.3皮肤和粘膜的取材皮肤和粘膜是上皮细胞培养的重要来源。取材方法似断层皮片手术，面积2-3mm2.尽可能去除皮下和粘膜下组织。因分布在体表，故细菌、霉菌很多，需严格消毒，可用较高浓度抗菌素漂洗。1.2.4内脏和

4、实体瘤的取材内脏除消化道和泌尿管道外基本是无菌的，明确取材部位，去除结缔组织。肿瘤组织取材避免坏死液化和结缔组织，标本应按污染组织处理。1.2.5血细胞的取材血细胞培养可用于造血干细胞移植、免疫活性细胞的治疗和染色体分析等。取血抗凝剂量过大易导致溶血，肝素常用浓度为20U/ml,针管用较高浓度肝素500U/ml湿润。1.3组织材料的分离欲从组织中获得大量生长良好的细胞，须将组织分散开，使细胞解离出来。常用方法有机械法和化学法。1.3.1细胞悬液的分离方法离心法：血液和体液等细胞悬液500-1000rpm转速5-10分钟。离心速度过大、时间过长，会造成细胞损伤和死亡。密度梯度离心法：用离心法将细

5、胞分到不同密度的梯度介质中，再分别吸出各层细胞。适于分离密度不等的的细胞。常用介质有Ficoll400,Percoll,泛影葡胺等。。1.3.2.1机械分散法适于较柔软的组织，如脑、肝、脾、淋巴结、胸腺、胚胎组织和肿瘤组织等。剪切组织为1mm3碎块后，置于组织匀浆研磨，或用吸管反复吹打分散组织细胞组织液放在注射器内通过针头压出。注射器针芯挤压后，用PBS液洗涤，分别通过不锈钢筛网80,150,400目孔径筛网。记数活细胞数，制成细胞悬液接种。1.3.2.3消化分离法消化法是结合生化和化学手段把已剪切成较小体积的组织进一步分化，获得细胞悬液直接进行培养1.3.2.3.1胰蛋白酶法主要作用是对细胞

6、间蛋白质水解，使细胞离散。活性以消化酪蛋白的能力测定，常用1：250消化效果与pH值、温度、酶浓度和组织块大小与硬度有关，对细胞分离作用与细胞的类型与性质关系密切钙镁离子和血清抑制活性常用剂量为0.25%（0.1-0.5%），pH值8（8-9）温度37。4度配制应用液。1.3.2.3.2胶原酶法只对细胞间质胶原组织起消化作用，使上皮细胞与胶原成份分离产品有I-VVII-IX等型，分别适用于分离肝细胞、胰岛、脂肪细胞肾及纤维组织钙镁离子和血清不影响活性,pH.6.5-7常用剂量为200单位/ml或0.1µg/ml~0.3µg/ml1.3.2.3.3EDTA法EDTA（二乙烯四乙酸二钠）作用较缓和

7、。主要作用：能从组织生长环境中吸取维持组织完整的钙镁离子。单独使用不能使细胞完全分散，常用1:1的EDTA（0.02%）和胰蛋白酶0.25%混合液2原代培养也称初代培养,是从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养。细胞保持原有的基本性质，仍具二倍体遗传物性。最接近和反映体内生长特性。适合作药物测试，细胞分化研究。原代培养细胞部分生物学特征尚不稳定，供体和细胞间有很大差异。2.1组织块培养法将组织剪