细胞培养基本技术

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1、细胞培养基本技术分子生物学实验室张华屏主要内容体外培养细胞的生长和增殖特点培养细胞所用的实验用品常用的培养器皿及其清洗消毒与灭菌液体的配置（培养基，平衡缓冲液，消化液等）细胞的处理（传代，冻存和复苏）体外培养细胞的分型(一）贴附型：大多数培养细胞属于贴附生长，贴壁依赖性细胞（二）悬浮型；见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易大量繁殖。血管内皮细胞胚胎干细胞培养细胞的生长和增殖过程（一）培养细胞的生命期（LifeSpanofCultureCells)，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。体内组织细胞的生存期与

2、完整机体的死亡衰老基本相一致。（二）组织培养细胞一代生存期所谓细胞“一代”一词，系仅指从细胞接种到分离再培养时的一段时间。（一）培养细胞的生命期培养细胞的生命期和细胞的种类、性状和原供体的年龄等情况有关。人胚二倍体成纤维细胞培养，在不冻存和反复传代条件下，可传30～50代，相当于150～300个细胞增殖周期，能维持一年左右的生存时间，最后衰老凋亡（Apoptosis）。如供体为成体或衰老个体，则生存时间较短。1．原代培养期（PrimaryCulture）也称初代培养，即从体内取出组织，接种培养到第一次传代阶段，一般持续1一4周。细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。初代

3、培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大，细胞群是异质的。初代培养细胞多呈二倍体核型。由于原代培养细胞和体内细胞性状相似性大，是检测药物很好的实验对象。2．传代期初代培养细胞一经传代便改称为细胞系（CellLine）。在全生命期中此期持续时间最长。在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系（DiploidCellLine）。3．衰退期此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。在细胞生命期阶段，少数情况下，在以上三期任何一点（多发生在传代末或衰退期），由于某种因素的影响，细胞可能发生自发转化（

4、SpontaneousTransformation）。转化的标志之一是细胞可能获得永生性（Immortality）或恶性性（Malignancy）。细胞永生性也称不死性，即细胞获持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系（InfiniteCellLine），也称连续细胞系（ContinuousCellLine）。细胞获不死性后，核型大多变成异倍体（Heteroploid）。（二）组织培养细胞一代生存期所谓细胞“一代”一词，指从细胞接种到分离再培养时的一段时间，它与细胞倍增一代非同一含义。如某一细胞系为第153代细胞，即指该细胞系已传代153次。它与细胞世代（Generati

5、on）或倍增〔Doubling）不同；在细胞一代中，细胞能倍增3～6次。细胞传一代后，一般要经过以下三个阶段：1.潜伏期细胞接种培养后，先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期。此时细胞胞质回缩，胞体呈圆球形。接着是细胞附着或贴附于底物表面上，称贴壁，悬浮期结束。细胞贴附于支持物后，除先经过前述延展过程变成极性细胞，还要经过一个潜伏阶段，才进入生长和增殖期。细胞处在潜伏期时，可有运动活动，基本无增殖，少见分裂相。细胞潜伏期与细胞接种密度、细胞种类和培养基性质等密切相关。初代培养细胞潜伏期长，约24～96小时或更长，连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短，仅6～24小时；细胞接种密度大时

6、潜伏期短。当细胞分裂相开始出现并逐渐增多时，标志细胞已进入指数增生期。2．指数增生期（LogarithmicgrowthPhase）：这是细胞增值最旺盛的阶段，细胞分裂相增多。指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。指数增生期是细胞一代中活力最好的时期，因此是进行各种实验最好的和最主要的阶段。在接种细胞数量适宜情况下，指数增生期持续3～5天后，随细胞数量不断增多、生长空间渐趋减少、最后细胞相互接触汇合成片。细胞相互接触后，如培养的是正常细胞，由于细胞的相互接触能抑制细胞的运动，这种现象称接触抑制（ContactInhibition）。而恶性细胞则无

7、接触抑制现象，因此接触抑制可作为区别正常与癌细胞标志之一。肿瘤细胞由于无接触抑制能继续移动和增殖，导致细胞向三维空间扩展，使细胞发生堆积（Piledup）。细胞接触汇合成片后，虽发生接触抑制，只要营养充分，细胞仍然能够进行增殖分裂，因此细胞数量仍在增多。但当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制（DensityInhibition），导致细胞分裂停止。因此细胞接触抑制和密度抑制是两个不同的概念，不应混淆。3．停滞期（StagnatePhase）细胞数