细胞培养基本技术(II)

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1、•细胞工程实验室设计–原则防止微生物污染和有害因素影响划分不同功能区或用铝合金隔板隔开无菌操作区应在室内较少走动的内侧清洗和消毒安置在另室–要求工作环境清洁、空气清新、干燥和无烟尘◆动物细胞培养室的设置准备室无菌间操作间培养室分析室◆温度：一般控制在在25±2ºC◆光照：光强、光质、光照时间一、动植物细胞工程实验室通用仪器设备超净工作台n超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。冰箱■普通冰箱（4℃，－20℃）■低温冰箱（－

2、20℃）■超低温冰箱（－80℃）电热干燥箱■烘干和干热灭菌玻璃器皿■100度以下时再打开箱门■金属器械、塑料制品、橡胶等不能在干燥箱内消毒压力蒸汽消毒器湿热灭菌，用途广n使用CO2培养箱培养细胞时应注意nCO2培养箱设定的条件为37℃％CO2。，5的问题：①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。②保持培养箱内空气干净。定期消毒（90℃，14 h)。③箱内灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。细胞冷冻储存器——液氮罐液氮温度：－196℃不断挥发，及时补充3.1细胞工程实验室条件◆实验室基

3、本组成◆实验用品与主要设备◆实验室的生物安全••••生物安全防护水平（BSL）由一级防护屏障（安全设备）和二级防护屏障（实验室设施）组合构成四级生物安全水平。一级生物安全防护水平（BSL－1）二级生物安全防护水平（BSL－2）三级生物安全防护水平（BSL－3）四级生物安全防护水平（BSL－4）生物安全四级(BSL—4)：处理特别危险的传染源生物安全一级(BSL1)：适合于非常熟悉的病源，不会经常引发健康成人疾病，对实验人员和环境潜在危险小。一般也不使用特殊的遏制设备和设施。生物安全二级(BSL—2)：适合于对人和环境有中

4、度潜在危险的病源，应在生物安全柜中或其它物理遏制设备中进行。生物安全三级(BSL—3)：该会引发严重的、可能致死的疾病的病源。在生物安全柜或其他物理遏制装置中进行，或由穿戴合适防护服及设施的实验人员进行。实验室经过特殊设计和施工。Summary：细胞培养的基本条件细胞保存条件：液氮罐无菌条件：净化工作室，高效过滤器，生物安全柜，超净工作台，紫外灯，电热干燥箱，滤器，高压灭菌器，抗生素细胞生长条件：纯水蒸馏器，纯水仪，培养板，培养瓶，CO2培养箱，培养基，血清细胞检测条件：倒置显微镜，酶标仪，微孔板震荡器，高速离心机，移液

5、器实验室安全：生物实验室安全，P1,P2,P3实验室安全Chapter 3细胞工程基本实验技术◆实验室设施与基本条件◆无菌技术◆显微技术◆细胞观察与分析◆细胞分离◆细胞保存与复苏3.2无菌技术◆培养用品清洗◆灭菌方法◆污染检测与控制一、玻璃器皿的清洗◆浸泡新瓶使用前用自来水简单刷洗，后用稀盐酸浸泡过夜。WHY?于6使用过的器皿应立即浸入水中，避免干涸难洗◆刷洗软毛刷沾洗涤剂洗涤◆浸酸关键一环。时间不少于小时，一般过夜。清洁液变绿应重新配制。◆冲洗洗涤装置与手工◆烘干、包装、高压（15磅20分钟）或干热（160度2小时）◆

6、常规清洗方法：水中浸泡自来水冲洗洗2-3次1%盐酸浸泡30分钟晾干包装、高压灭菌二、胶塞的清洗◆新购置胶塞有大量滑石粉，用自来水洗净，再常规处理2%NaOH煮沸10-20分钟自来水冲洗蒸馏水清三、包装消毒筒●局部包装◆包装材料有皱纹包装纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒及金属●全包装小物品装饭盒，注意期限，标明物品名。吸管用脱脂棉将管接口端堵塞，装入消毒筒，筒底垫棉花3.2无菌技术◆培养用品清洗◆灭菌方法◆污染检测与控制•操作人员的手部？•实验室桌面、地面等？细胞培养室中下列物品该如何消毒？•玻璃培养瓶，移液管，试管等玻璃器皿？•

7、超净工作台台面？•金属手术器械？•不耐热的液体培养基和胰蛋白酶等？•橡胶塞和塑料瓶盖等？•细胞培养室？消毒（1）物理消毒•火焰•射线消毒：钴60（60Co），用于牛血清、塑料制品•紫外线消毒空气、操作台表面。紫外灯距地面2.5米•干热消毒玻璃器皿160度保持90120分钟•湿热消毒布类、胶塞、金属器械、玻璃器皿某些液布体物品不宜过满液体和橡胶制品10磅10分钟类、金属器械、玻璃器皿15磅20分钟•滤过消毒培养用液0.22 µm微孔滤膜消毒（2）化学消毒•来苏尔（煤酚皂）•0.1%新洁尔灭• 70％（或75％）酒精• 0.

8、5过氧乙酸抗生素消毒气体消毒：37％甲醛加热沸腾后，加适量高锰酸钾，关门窗1～3天煮沸消毒物品湿热干热过滤培养室工作台玻璃制品＋＋＋＋金属器械塑料制品＋橡胶制品培养用液布类棉类＋＋＋＋紫外化学气体消毒剂电离辐射＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋消毒与灭菌重要概念1.消毒2.灭菌3.防腐4.无菌杀死物体上病原微生物的方法；并不一