细胞培养的基本技术

《细胞培养的基本技术》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、细胞培养CellCulture2第四章细胞培养的基本技术4.1基本操作技术和要求3培养前准备制订试验计划和操作程序准备各种器材物品培养室和超净台的消毒0.2%新洁尔灭托洗地面紫外灯照射30-60分钟以75%乙醇擦拭无菌操作台面培养室内的无菌操作4洗手和着装彻底洗手以75%乙醇消毒手和前臂可穿经紫外线照射30min的一般清洁工作服。无菌培养操作一切操作都应在火焰近处并经过灼烧进行。小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上

2、放置桌面。培养室内的无菌操作5678910无菌操作中常犯的错误吸管、剪刀等碰到其他器皿11无菌操作中常犯的错误正确的拿管姿势错误的拿管姿势拿吸管时手碰到无菌区！12无菌操作中常犯的错误培养基浸湿吸管底部的棉花134.2原代培养14将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。如系组织块培养，则直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。如系细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。细胞

3、和组织培养15计数细胞细胞数/ml=计数16格×稀释倍数×10416原理：（1）计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercounter粒子计数器自动计数。（2）血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber中细刻9个1mm2大正方形，其中4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为0.1mm。当chamber上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml中之细胞数目。（3）存活测试之步骤为dyeexclusion（染料排除），利用染

4、料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypanblue染料，如果细胞不易吸收trypanblue，则用红色之Erythrosinbluish。计算细胞活率：活细胞数/（活细胞数+死细胞数）×100%。计数应在台盼兰染色后数分钟内完成，随时间延长，部分活细胞也开始摄取染料；因为台盼兰对蛋白质有很强的亲和力，用不含血清的稀释液，可以使染色计数更为准确。17两个概念原代培养直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养物。一旦已进行传代培养（Subculture）的细胞，便不再称为原代培养，而改称为细胞系。

5、传代培养细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。每传代一次称为“一代”。二倍体细胞一般只能传几十代，而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。18培养细胞的取材理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。19组织块培养法新鲜取材的组织中细胞仍具有分裂增殖的能力。将组织切成小块培养在模拟体内的环境中，小块组织的细胞可以游离出来，从培养液中吸取营养，继续分裂生长。组织块培养法适用范围广，常用于肝脏、

6、皮肤、角膜、骨骼、韧带、血管、神经、心脏等器官和组织的培养。5820212223242526培养要点材料新鲜严格无菌操作剔除脂肪等附着组织组织块剪小（直径﹤1mm）摆放开（间距﹥5mm）27常犯的错误操作中不换器械冲洗次数不够组织碎片太大组织块摆放太密培养液加入太多28消化培养法消化培养法所用的酶有多种，目前应用最广的是胰蛋白酶。它是一种内切酶，可专一水解有精胺酸或赖氨酸的羧基形成的肽键。从而消除妨碍细胞生长的细胞间质，包括基质、纤维等，使细胞分散，易于贴壁并从外界吸收养分和排除代谢物消化法适用于组织量大的原代培养。胰蛋白酶液适用于消化间质少的组织，如羊

7、膜、胚胎、上皮、肝和肾等组织及传代细胞。592955切成1--2mm3小块20--60min30313233343536培养要点36合适的胰蛋白酶浓度（通常为0.25%）合适的消化时间：消化时，待组织块变得较疏松，颜色略白为止（通常为37℃，20-40分钟）37常犯的错误水浴锅未预热组织块太大38胰蛋白酶消化不足或过度吹打用力过重常犯的错误394.3传代培养和细胞系的维持40传代细胞培养细胞在原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶的操作叫传代。为获得稳定的细胞株，或大量的同种细胞，当培养细胞形成致密的单层后需进行传代培养。6341首次传代注意事项细胞没有生长

8、到足以覆盖瓶底壁的大部分表面以前（80%），不要急于传代。传代时不同的细胞有不同