细胞培养基本技术概述

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1、细胞培养基本技术概述无菌操作基本技术1.实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminarflow)以紫外灯照射30-60分钟灭菌，以70%ethanol（乙醇）擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70%ethanol擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。2.无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管

2、架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70%ethanol擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。3.小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖的盖口朝上放置桌面。4.工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等

3、级之无菌操作台(至少ClassII)。操作过程中，应避免引起aerosol（浮质）之产生，小心毒性药品，例如DMSO及TPA等，并避免尖锐针头之伤害等。5.定期检测下列项目：5.1.CO2钢瓶之CO2压力5.2.CO2培养箱之CO2浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。5.3.无菌操作台内之airflow压力，定期更换紫外线灯管及HEPA过滤膜，预滤网(300小时/预滤网，3000小时/HEPA)。6.水槽可添加消毒剂(Zephrin1:750)，定期更换水槽的水。实验用品1.种类︰1

4、.1.细胞培养实验用品均为无菌，除了玻璃容器与pasteurpipet（巴斯德移液管）外，其它均为塑料无菌制品。1.2.TC级培养盘（高透明卫生级,SEBS氢化级,优良的物性,可包胶PP,舒适的手感,适用于高档产品）表面均有coating高分子物质以让细胞吸附，培养容器种类有Tflask,plates,dishes,rollerbottle等，依实验需要使用。1.3.plasticsterile（不生育的;贫瘠的；消过毒的,无菌的）pipet:1ml,2ml,5ml,10ml,25ml1.4.塑料离心管:1

5、5ml,50ml，均有2种不同材质，其中polypropylene(PP)为不透明材质，polystyrene(PS)为透明材质，可依实验需要而选择适合材质之离心管。1.5.glasspastuerpipet:9inch，用以抽掉废弃培养液等。1.6.玻璃血清瓶(PyrexorDuranglassware)：100ml,250ml,500ml,1000ml2.清洗︰2.1.新购玻璃血清瓶先以0.1~0.05NHCl浸泡数小时，洗净后才开始使用。2.2.用过之玻璃血清瓶，以高压蒸汽灭菌，洗净后分别用一次与二次

6、去离子水冲洗干净，勿加清洁剂清洗。3.灭菌︰3.1.实验用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖，高压蒸汽灭菌121oC,15lb,20min，置于oven中烘干。3.2.实验用玻璃pasteurpipet以干热灭菌170oC,4小时。3.3.液体或是固体废弃物可用10%hypochloride溶液(次氯酸，即漂白水)或是蒸汽高压灭菌121oC,15lb,20min处理。培养基1.液体培养基贮存于4oC冰箱，避免光照，实验进行前放在37oC水槽中温热。2.液体培养基(加血清)存放期为六个月，期间glutamine（谷氨

7、酰胺）可能会分解，若细胞生长不佳，可以再添加适量glutamine。3.粉末培养基配制(以1升为例)：3.1.细胞培养基通常须添加10%血清，因此粉末培养基之配制体积为900ml，pH为7.2-7.4。NaHCO3为另外添加，若将NaHCO3粉末直接加入液体培养基中会造成pH之误差，或局部过碱。因此粉末培养基及NaHCO3粉末应分别溶解后才混合，然后用CO2气体调整pH，而非用强酸(HCl)或强碱(NaOH)，因为氯离子对细胞生长可能有影响，且贮存时培养基的pH易发生改变。3.2.材料：3.2.1.纯水(m

8、illi-Q水或二次至三次蒸馏水，水品质非常重要)3.2.2.粉末培养基3.2.3.NaHCO3(SigmaS-4019)3.2.4.电磁搅拌器3.2.5.无菌血清瓶3.2.6.0.1或0.2mm无菌过滤膜3.2.7.pHmeter3.2.8.真空帮浦3.2.9.CO2气体3.3.步骤：3.3.1.取粉末培养基溶于700mlmilli-Q水中，搅拌使其溶解。3.3.2.称取适量之NaHCO3粉末(数量依培养基种类