植物原生质体培养与体细胞杂交

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1、第九章植物原生质体培养与体细胞杂交原生质体培养的意义第一节原生质体的分离与纯化第二节影响原生质体产量和活力的因素第三节原生质体的培养第四节由原生质体再生植株第五节体细胞杂交第六节原生质体的应用价值原生质体培养的意义1、原生质体的特性（1）去壁的原生质体容易实现外源遗传物质的导入和吸收。（2）原生质体具有细胞全能性。（3）不同来源的原生质体具有彼此融合的能力。2、原生质体培养应用（1）克服植物有性杂交的障碍，扩大物种间遗传物质交流的范围，创造有利变异，培育新品种。（2）作为独特的实验系统，用于体细胞遗传、生理、病理等方面的基础理论研究。第一节原生质体的分离与纯化一、原生质体的分离（一）分离原

2、生质体的材料来源（二）分离方法1．机械分离法2．酶法分离（三）技术程序二、原生质体的纯化（一）分离原生质体的材料来源游离原生质体时，植物叶片、花瓣、果实组织、子叶、下胚轴、幼根、茎叶、愈伤组织、悬浮细胞等都可作为材料来源，但常用于分离原生质体的材料为：1、叶片叶片来源丰富，供应及时，有明显的叶绿体存在时也便于在细胞融合中识别。2、试管苗的子叶、胚轴或茎尖等无菌材料3、愈伤组织或悬浮培养细胞。（二）分离原生质体的方法1、机械分离法2、酶法分离酶法分离是利用纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶等酶类降解细胞壁成分，获得原生质体的方法。（1）分离原生质体的酶类（2）酶解分离原生质体的方法（3）酶解分离原生

3、质体应注意的问题根据植物材料种类选择所用酶的种类、处理浓度、和处理时间。酶解分离时应提供适宜的渗透压保护，以防原生质体破裂。（1）分离原生质体的酶类酶的类型作用常用种类纤维素酶降解细胞壁中纤维素成分，游离原生质体。OnozukaR-10半纤维素酶降解细胞壁中的半纤维素成分。PhozymeHP-150果胶酶降解相邻细胞间的果胶质，使细胞游离。MacerozymeR-10（2）酶解分离原生质体的方法①两步分离法这种分离方法是先用果胶酶离析植物组织，使植物细胞从组织中分离出来，然后收集细胞经洗涤后用纤维素酶解离细胞壁，最后获得原生质体。②一步分离法即把一定量纤维素酶和果胶酶组成混合酶液，对材料

4、进行一次性处理，处理温度25~30℃，处理的时间根据材料及酶浓度的不同而不同，可为2～24h。（三）游离原生质体的技术程序1、材料准备：称重、灭菌与研碎。2、预处理：研磨、切割、暗培养等。3、酶解：加入酶液，保育处理；4、收集纯化：过滤去除组织碎块；离心纯化原生质体。5、活力检测6、原生质体的培养原生质体再生细胞壁细胞分裂，形成愈伤组织愈伤组织分化成苗二、原生质体的纯化（一）离心沉淀法(过滤浓缩法）（二）接口法选用两种不同渗透浓度的溶液，其中一种溶液的密度大于原生质体的密度，另一种溶液小于原生质体的密度，原生质体经适当速度离心后即介于两种溶液之间。（二）漂浮法（一）离心沉淀法1、方法：

5、先将经酶处理的原生质体悬浮液用400目网筛过滤，滤液经500～1000r/min离心5～6min后，吸去上清液，然后用一般洗涤液重新悬浮，离心沉淀，如此重复2～3次。最后再用原生质体培养液洗1次，收集原生质体备用。2、注意：（1）整个过程用相同的渗透液，渗透压以稍高于原生质体内渗透压，细胞稍微发生质壁分离为好。（2）常用的原生质体清洗介质为CPW溶液；（3）这种方法简便，但不能完全除尽少量脱壁不完全的细胞和破碎的原生质体。（二）接口法1、方法：先在离心管底加入山梨醇或蔗糖的浓溶液（21%），再小心的加入过滤处理的酶-原生质体混合液，以合适的速度离心，原生质体将聚集于两液面之间。小心取出原生质

6、体转入另一离心管，用清洗介质清洗、离心，重复3次。最后以适当的密度悬浮于液体培养基中。2、优劣该法可收集较纯的原生质体，且原生质体破碎较少。但采用的高渗溶液往往对原生质体伤害较大。用此法的关键是控制好蔗糖或山梨醇的浓度及离心速度，使原生质体漂浮于单一界面，且不影响原生质体的稳定性和活力。第二节影响原生质体产量和活力的因素一、材料来源（一）植物叶片（二）培养细胞二、预处理三、酶处理四、渗透压（一）植物叶片当从植物叶片分离原生质体时，植株的生长环境、植株年龄等对原生质体的分离和培养影响较大。１、植株年龄对一年生草本：生长40-60天的幼叶；对多年生木本：幼龄且充分展开的叶片。２、母株生长环境母

7、株生长在低光强（10001x）、短日照、温度20℃~25℃、相对湿度60％～80％的条件下，以及较高的氮肥供应。３、采用离体苗叶片（二）培养细胞由培养细胞分离原生质体，其产量取决于培养细胞的生长速率和生长时期。频繁继代可促进细胞的旺盛分裂，生长时期以处于对数生长早期的细胞为好。即：频繁继代（每2~3天继代1次）的悬浮培养物以及处于对数生长早期的细胞是最适宜的供体材料。利用培养细胞分离的原生质体往往容易实现细胞