植物原生质体培养和体细胞杂交

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1、植物原生质体培养和细胞融合原生质体的分离与培养概念及研究进展原生质体融合原生质体(protoplast)：脱去细胞壁、裸露的细胞。又称原生质球原生质体是为质膜所包围的裸露细胞。亚原生质体(subprotoplast)在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的断裂而形成的一些较小的原生质体。它可以具有细胞核，也可不具有细胞核。核质体(nuclearplast)由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体。也称为微小原生质体。胞质体(cytoplast)不含细胞核，而仅含有细胞质的原生质体。ProtoplastsystemOrganogenesisRegenerativeabilityO

2、ntogenicprocessesCelldifferentiationSomaticgeneticsCellphysiologyCellcloningOrganelle,DNAuptakeCellfusion应用植物细胞育种中的核质替换细胞质杂种的获得远缘杂交创造新物种细胞细胞器的互作研究意义植物原生质体的分离和培养材料预处理原生质体分离的方法原生质体纯化原生质体活力测定影响原生质体数量和活力的因素原生质体培养方法影响原生质体培养的因素原生质体再生过程Flash用于分离原生质体的材料材料预处理用黑暗处理、低温处理和不同光质照射等方法，可提高某些材料原生质体的产量和活力。☆龙胆试管苗的叶片用4

3、oC处理较好。☆甘蔗植株必须先在黑暗下培养12h后分离的原生质体才能分裂。☆马铃薯试管苗叶片需在黑暗下处理48h后分离原生质体，才能获得高产量。机械分离法：先将细胞放在高渗糖溶液中预处理，待细胞发生轻微质壁分离，原生质体收缩成球形后，再用机械法磨碎组织，从伤口处可释放出完整的原生质体。缺点：获得完整的原生质体的数量比较少，能够用此法产生原生质体的植物种类受到限制。优点：该方法可避免酶制剂对原生质体的破坏作用。酶解分离法：指将材料放入能降解细胞壁的混合等渗酶液中保温一定时间，在酶液的作用下，细胞壁被降解，从而获得大量有活力的原生质体的方法。常用的酶种类：纤维素酶类（纤维素酶、半纤维素酶、崩溃酶[

4、Driselase]）、果胶酶类（果胶酶和离析酶[Macerozyme]）、蜗牛酶和胼胝质酶。酶来源生产厂家纤维素酶类OnozukaR-10绿色木霉YakultHonshaCo.Ltd.,Tokyo,JapanCellulysin绿色木霉Calbiochem.,SanDiego,CA92037,USADriselaseIrpexlutensKayowaHakkoKogyoCo.,Tokyo,Japan酶来源生产厂家果胶酶类MacerozymeR-10根霉YakultHonshaCo.Ltd.,Tokyo,JapanPectinase黑曲霉SigmaChemicalCo.PectolyaseY-

5、23黑曲霉SeishinPharm.Co.Ltd.,Tokyo,Japan半纤维素酶RhozymeHP-150黑曲霉RohmandHassCo.,Rhiladelphia,UAS酶解法的优缺点优点：获得量大，适用广泛。缺点：商品酶制剂均含有核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶以及酚类物质。会影响所获原生质体的活力。沉降法漂浮法不连续梯度法原生质体纯化的方法飘浮法Protoplast采用比原生质体密度大的高渗溶液（蔗糖、Percoll、Ficoll），使原生质体漂浮在液体表层的纯化方法。优点：可以避免分离的原生质体因震荡被组织碎片撞击而破损。所用药品简单，成本低。缺点及补救措施：对离心力要求比较严格，掌握

6、不好，原生质体则不易漂浮。可采用不同浓度和不同离心速度分次漂浮的方法。沉降法利用比重原理，在具有一定渗透压的溶液中，先进行过滤然后低速离心，使纯净完整的原生质体沉积于试管底部。优缺点：纯化原生质体比较简单。由于原生质体沉积于试管底部，造成相互挤压，常引起原生质体的破碎。又称界面法，采用两种密度不同的溶液形成不连续梯度，通过离心使原生质体与破损细胞分别处于不同液相中，从而纯化原生质体的方法。优点：可以收集到数量较大的纯净原生质体，同时避免收集过程中原生质体因相互挤压而破碎。12mL碎片带含原生质体带0.6mL0.45M蔗糖0.45M甘露醇不连续梯度法原生质体鉴定低渗爆破法荧光增白剂法(calco

7、flowerwhite0.1%)原生质体活力测定形态识别形态完整、富含细胞质、颜色新鲜的正常球形，放入低渗溶液中，可正常膨大。原生质体活力测定荧光显微镜识别(FDA法)FDA(fluoresceindiacetate)本身不发荧光也不具有极性，能自由穿过细胞质膜。活细胞内FDA可以被酯酶裂解，将能发荧光的极性部分释放出来。荧光素则不能自由穿越质膜，在完整的活细胞内积累。使用浓度：0.01%原生质体