第六章原生质体培养和体细胞杂交

《第六章原生质体培养和体细胞杂交》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、第六章原生质体培养和体细胞杂交第一节原生质体分离与培养一、原生质体培养的意义与研宄概况原生质体（protoplast,PPT）:用机械或酶解法去掠细胞壁的裸露细胞。1.原生质体培养的意义与研究概况1.1培养意义1）体细胞杂交；作物遗传改良，这是一种新的远缘杂交方法，为人们提供新的育种方法。两个亲缘关系较远的植株用一般杂交方法是不容易成功的，而用细胞融合的方法却成为可能。2）遗传转化的受体，避免嵌合体；3）突变体筛选：体细胞无性系变异+离体诱变；4）基础研究：细胞壁再生、膜结构、跨膜运输、病毒侵染、抗寒性、抗热性等；5）种质资源超低温保存，并可研究低温伤害与胞内结冰等；6）

2、细胞器和大分子分离。1.2研究概况1880,Hanstein,提出原生质体；1892,Klcrckcr,机械法分离少呈原生质体；1960,Cocking,纤维素酶分离番茄幼根，得大量活性原生质体，奠基；1968,纤维素酶和离析酶上市，迅速发展；1971,Takebe,酶解分离烟草叶肉原生质体，再生植株；1985,Fujimura等，世界第一例禾谷类作物，水稻原生质体再生植株；1986,通过甘蓝型汕菜单个原生质体培养获得再生植株。单个原生质体培养成功；至1999,46科、161属、368种高等植物，原生质体再生植株，但若干重要作物仅限于少数基因型，再生率不高，培养基和培养程

3、序复杂，规律少。二、原生质体的分离与纯化2.1原生质体分离2.1.1原则：大量、避免损伤，高活力，能进行分裂并形成愈伤组织或胚状体是原生质体培养成功的基础。取紂：叶片，愈伤组织，悬浮细胞2.1.2分离方法：1）机械法：用解剖刀切碎质壁分离的组织，再通过质壁分离［pkz’nDlisis］的复原释放出原生质体。优点：物理损伤，排除了外加酶的有害影响。缺点：产量低，操作不便，只限于能发生质壁分离的组织（适于高度液泡化细胞，不适于分生组织）；费时费力。补充：细胞壁组成：a.胞间层middlelamella:位于两个相邻细胞之间，为两相邻细胞所共有的一层膜，主要成分为果胶质。b.初

4、生壁ThePrimaryWalk位于胞间层A侧。主要成分为纤维素、半纤维素，a.次生壁secondarywall:位于质膜和初生壁之间。主要成分为纤维素，并常有木质存在。2）酶解法：常用混合酶液•一步完成，广泛应用。叶肉细胞、愈伤组织和悬浮细胞，缺点：不纯的酶制剂可能对原生质体有害。2.1.3分离原生质体的酶液组成1）细胞壁组成：纤维素25%〜50%,半纤维素53%,果胶质5%。2）酶液的组分及其作用：以最少品种和最少量，但能分离得到健康的原生质体为准。纤维素酶和果胶酶为必需酶。一般叶片用纤维素酶和果胶酶：愈伤组织或根再添加半纤维素酶。纤维素酶：必需，降解纤维素，果胶酶：

5、必需，降解果胶质，离析酶：降解果胶质，半纤维素酶降解半纤维素，蜗牛酶或胼胝质酶：降解小孢子壁（胼胝质）；崩溃酶：兼具纤维素酶、果胶酶等酶活；3）渗透稳定剂：促进酶解作用，保持原生质体的完整性，使既不涨破乂不因过分收缩而破坏内部结构。糖醇系统:露醇、山梨醇、葡萄糖和蔗糖甘辦醇：调节渗透压，应高于原生质体，0.3〜08M;盐类系统:CaC12、MgSO4、KC1和葡聚糖硫酸钾CaC12：稳定质膜，提髙诏力；KH2PO4/葡聚糖硫酸钾：稳定质膜，提高活力；MES（2，N-氮吗啉-乙基磺酸）：稳定pH;pH：5.6〜5.8。2.1.4常用CPW液（细胞•原生质体清洗液）配制酶液和

6、洗涤液。CPW液的组成：KH2PO4KNO3CaC12•2H2OMgSO4•7H2OKICuSO4•5H2OpH27.2mg/LlOl.Omg/L1480.0mg/L246.0mg/L0.16mg/L0.025mg/L5.82.1.5用酶法制备原生质体的程序从带菌叶片分离：预处理一（表面消毒一去表皮/擦伤/切碎）一酶解分离（25〜3（TC），避光，静置或间断低速®荡，30min〜20h）纯化。从无菌苗、愈伤和悬浮细胞分离：省去消毒和去皮。预处理：主要目的是便于原生质体分离和促进细胞分裂，高渗hypertonic[haips'tonik]、激素、低温等。去表皮或擦伤：利于酶

7、液渗入和PPT释放。2.1.6酶解条件最主要的是酶处理时的温度和pH。不同的酶需要的pH值不一样，但pH大于6时不利于原生质体生存。酶解时间因材料而不同，以原生质体游离下來力准。一般不要超过24h，时间太长不利于原生质体培养，对以后培养屮的细胞生长和分裂有影响。酶解温度一般为25〜27'C。一般在黑暗中进行，叶片分离原生质体可在静置条件下进行，悬浮细胞由于壁厚，培养（分离）过程中间断低速震荡有利于酶渗透。2.2原生质体的纯化经酶解处理后，得到的浞合物是一个由原生质体、细胞团与细胞碎片等组成的浞合液，只有将杂质和酶液去掉，使原生