植物育种学-植物原生质体培养与体细胞杂交

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1、植物育种学第12章----生物技术在植物育种中的应用第二节---植物原生质体培养与体细胞杂交制作人：2010级种子二班宋子超201027922012.11.11植物原生质体培养与体细胞杂交植物原生质体培养是指将植物细胞去壁后，在无菌条件下，使其进一步生长发育的技术。体细胞杂交是在离体条件下将同一物种或不同物种的原生质体融合，培养并获得杂种细胞的再生植株。自1971年烟草叶片分离原生质体并培养获得再生植株以来，已有280余种植物原生质体再生植株问世。原生质体融合克服了植物种属间生殖障碍，为新种质的创造提供了一条有效途径过程：1、

2、原生质体的分离与培养2、原生质体融合3、杂种细胞的选择4、杂种细胞的鉴定一、原生质体的分离与培养（一）原生质体的分离1、制备原生质的材料：分为①、自然条件下生长的植株：可以从植株各个组织器官分离原生质体，常用的是叶肉细胞（来源方便、供应及时、有明显的叶绿体便于在融合中识别）②、无菌幼苗：无菌幼苗的子叶、下胚轴和根均可分离。优点：无需经表面灭菌处理，避免杀菌剂对材料的伤害，且实验结果容易重复。缺点：培养室光照不够，苗弱制备原生质体的产量比较低，质膜较易破。③、外植体来源的愈伤组织、体细胞胚及悬浮培养细胞：优点：这种材料可避免环境

3、条件的不良影响，可常年供应，易于控制新生细胞的年龄，处理时操作方便。缺点：染色体不稳定，长期培养的细胞培养物是整倍体与非整倍体的混合物，使植株再生率降低。2、材料的预处理目的是为了提高原生质体的产量和代谢活力；逐步降低植物细胞水势，增强原生质体对培养及高渗透压的适应；使游离的原生质体更能适应新的培养条件。处理方法：①：预培养法：材料先在一定配方培养基上培养然后再分离原生质体②：暗处理法：材料暗处培养一定时间再分离原生质体③：药物及添加剂处理法：材料在添加剂或药物处理后，再进行原生质体的分离④：萎蔫处理法：离体叶片置日光或灯光下

4、照射2~3小时，叶片稍萎调，易于撕去下表皮，有利于酶降解叶肉细胞壁⑤：更新培养基法3、原生质体的分离植物原生质体分离有机械分离和酶分离法，目前一般采用酶法分离，酶法分离是指在酶的作用下分解细胞壁获得原生质体，优点是快速大量。酶法分离注意事项：①、酶的种类和用量：根据植物材料不同以及细胞壁成分不同确定。纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶。②、酶液的渗透势：细胞内外的渗透压必须平衡否则原生质体易破裂。③、酶液的酸碱度：酶液的PH对原生质体的产量和活力有很大的影响。不同植物材料对酶液的PH要求有别。④、温度环境：分离时间与温度和不同的材料

5、酶活力植物细胞特点有关。⑤、通气条件对原生质体的量和质也有明显的影响：通气良好原生质体量多健康，否则产量低健康的少。4、原生质体的纯化酶分解后的植物组织是由未消化的细胞和细胞团、破碎细胞及原生质体等组成的混合物，需提纯。方法有：①：过滤-离心法：简单易收集大量原生质体，常用。②：漂浮法：根据原生质体、细胞或细胞碎片的相对密度不同而设计的。5、原生质体的活力测定原生质体的活力测定，原生质体的活力测定决定以后的培养成功。形态识别：完整饱满的细胞质、颜色鲜艳、正常膨大。→有活力！（二）、原生质体培养1、培养基及培养条件：不同植物的原

6、生质体对营养需求不同。KM培养基、V-KM培养基除培养基外还注意：（1）、植物激素：生长调节剂的种类和浓度，2,4-D。（2）、原生质体的密度（3）、光照和温度（4）、氮源种类2、原生质体培养方法：固体培养法和液体培养法3、原生质体培养过程培养条件满足的条件下，原生质体首先会形成新的细胞壁，继而进行分裂，形成细胞团。在促进分化的条件下还能分化出芽、茎、根，再生成完整植株。（1）、细胞壁再生：再生壁开始的时间随所用的植物材料种类及取材来源而异。（2）、细胞分裂：第一次细胞分裂依赖于壁的形成。（3）、植株再生：原生质体形成小的细胞

7、团或愈伤组织，转移到固体分化培养基上后就开始形态发生而逐渐长成完整的植株。原生质体来源的细胞器官发生也可以通过两条途径：一是通过愈伤组织形成不定芽，另一条途径是由植物原生质体再生细胞在培养中直接诱导类胚体，由类胚体发育成完整植株。