植物细胞培养及原生质体培养

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1、第十章植物细胞及原生质体培养一、植物细胞培养：在一定条件下，通过人工供给营养物质及生长因子，使离体植物细胞生长繁殖的方法。细胞培养技术主要用于研究细胞生长、发育与分化等理论以及用于植物次生代谢物质生产。（一）细胞培养(cellculture)的特性：1.植物细胞较微生物细胞大，具有纤维素细胞壁，抗剪切力差；2.细胞生长速度慢，易受微生物污染，有时需用抗生素；3.细胞生长的中期及对数期，易凝聚为直径达350um一400um的团块，悬浮培养较困难；4.培养时需供氧，培养液粘度大，不能耐受强力通风搅拌；并具有群体效应5.培养细胞产物滞留于细胞内，且产量较低，培养过程具有结构与功能全能性。1

2、(二)植物细胞培养的营养需求及培养基１.营养需求：植物细胞生长所需营养较微生物细胞复杂，除水分外，其它营养成分可分为如下几类：(1)无机营养:如N、P、K、Ca、Mg、Fe、Cu、Mn、Zn、B、Mo、I等；(2)维生素：如维生素B1、B6、烟酸、肌醇、生物素、泛酸钙及叶酸等；(3)碳源:如蔗糖、葡萄糖、木糖、甘露糖及山梨醇等；(4)天然物:如水解乳蛋白、水解酪蛋白、椰乳、酵母提取液、香蕉汁、荸荠汁、生梨汁及苹果汁等；(5)植物激素:如生长素、赤霉素、细胞分裂素、脱落酸；其它有油菜素内酯、三十烷醇、肽类、半支莲醇、月光花素、石蒜素、玉米素等；(6)氨基酸类:如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬氨

3、酸、丝氨酸、赖氨酸、亮氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、组氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、苏氯酸、苏氨酸、酪氨酿、精氨酸、丙氨酸及半胱氨酸等；(7)核酸及其水解物:如DNA、RNA、黄嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤、鸟嘌呤及胸腺嘧啶等；(8)其它成分:如氯化胆碱、胆质素、胶氨酸、苹果酸及反丁烯二酸等.2.培养基：(1)固体培养基：添加琼脂等(2)液体培养基：不加琼脂等(三)植物细胞培养技术实验室中有悬浮培养、固相化培养、单细胞培养（微室培养、平板培养、看护培养、悬滴培养、微滴培养）等多种培养方式。1.悬浮培养法：植物细胞悬浮培养(cellsuspensionculture)即植物细胞或小的细胞聚集体在液体培养

4、基中于摇床上进行悬浮培养，这些细胞和小的聚集体来自愈伤组织，某个器官或组织，甚至幼嫩的植株，通过物理或化学的方法进行分离而获得。(1)优良的悬浮细胞培养体系必需满足：A.悬浮培养物分散性好，细胞团较小，一般由几十个以下的细胞组成。B.均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。C.生长迅速，悬浮细胞的量一般2—3天甚至更短时间便可增加一。(2)培养过程：将愈伤组织、无菌苗、吸涨胚胎或外植体芽尖、根尖及叶肉组织，经匀浆器破碎、纱布或不锈钢网过滤，单细胞滤液作为按种材料，接种于液体培养基中振荡培养。(3)悬浮培养特点：培养过程中细胞总数不断增加，一定时间后产量达最高点，生长趋于停止。然后进行

5、移植继代培养，其过程表现出严格可重复周期性变化，细胞增长规律与微生物相同，有延迟期、对数生长期、减慢期及静止期等阶段。植物细胞接种时要达到一定细胞浓度，通常为0.25xl0‘细胞／ml一0.5x10‘细胞／m1。(4)悬浮培养类型：A.成批培养(Batchculture)：成批培养是在一个封闭的系统中进行细胞培养。细胞材料生长在已固定体积的培养基中。随着细胞数量的增加，培养基营养的消耗及某些其他因子的积累会使细胞停止生长。继代培养需取出少量培养物转接于新鲜培养液中。生长过程包括延迟期、指数期、静止期等。分缓慢转动培养（1-2rpm）、震荡培养（100rpm）、快速转动培养（80-12

6、0rpm）和搅拌培养。B.连续培养(Continuousculture):是用一定容积的非密闭系统进行细胞培养的方法，在培养过程中不断注入新鲜培养基，而使营养物连续得到补充，细胞生长和增殖连续进行，同时有等体积的培养物排除系统。最大特点是细胞生长速率标准一致，新形成的细胞补偿了被排出的细胞，系统内细胞密度、生长速度、化学成分、细胞代谢活性都维持恒定。可通过改变培养基及培养条件建立恒定系统。恒化控制：通过营养液或某一成分恒浊控制：比浊计测定浑浊度而进行流量控制。2.固相化培养技术：细胞固定在一定的惰性基质中，如琼脂、海藻酸盐、聚丙烯酰氨纤维膜上，细胞不能运动，但营养液可以在基质中流动。

7、（1）固相化培养的特点：A.消除剪切力；B.细胞生长缓慢，促进次生代谢过程；C.细胞之间紧密接触，形成梯度，利于产物积累；D.便于操作，不易污染。E.便于产物收集。(2)固相化培养系统：A.平床培养：生长慢，代谢产物多，但不易放大。B.填充床培养：条件控制困难。C.膜生物反应器：采用一定孔径和选择透性膜来固定营养物，营养物可以通过膜渗透到细胞中。3.单细胞培养：对单离的细胞进行培养的方法。（1）平板培养法：分散的植物细胞接种于含薄层固体培养基的培养皿内的培