植物组织培养第七章植物原生质体培养及细胞融合

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1、第七章植物原生质体培养及细胞融合陈传红制作www.ecit.edu.cn2007/5本章内容提要：原生质体培养的发展与意义原生质体的分离原生质体的培养植物细胞的融合体细胞杂种鉴定方法陈传红制作www.ecit.edu.cn2007/5什么是原生质体（Protoplast）？1880,Hanstein：质壁分离时，能够与细胞壁分开的那部分细胞物质含义：去掉细胞壁的由质膜包裹、具有生活力的裸露细胞。Protoplast陈传红制作www.ecit.edu.cn2007/5细胞陈传红制作www.ecit.edu.cn2007/5微丝叶绿体线粒体质膜液泡细胞核内质网微管细

2、胞壁高尔基体植物细胞模式图细胞壁主要成分：纤维素25-50%、半纤维素53%和果胶5%陈传红制作www.ecit.edu.cn2007/5一、发展简史及其意义1、发展史1892年：Klercker机械法(利刃)分离原生质体；1960年：英国诺丁汉大学Cocking教授率先利用真菌纤维素酶，制备了大量具有高度活性可再生的番茄幼根细胞原生质体；1968年：纤维素酶和果胶酶投入市场；1968年：Takebe首先用商品酶进行原生质体分离：烟草叶肉原生质体，两步法和一步法。陈传红制作www.ecit.edu.cn2007/51971年：Takebe培养烟草叶肉原生质体，首

3、次获得再生植株。1986年：Spangenberg对单个原生质体培养获得成功。1993年：有49个科、146个属的320多种植物，经原生质体培养得到了再生植株。主要是农作物和经济植物，如大豆、棉花、油菜、水稻、玉米、柑桔、苹果、马铃薯、胡萝卜等；陈传红制作www.ecit.edu.cn2007/52、原生质体培养的意义（1）为细胞融合奠定基础克服有性杂交不能进行细胞质交流的不足。陈传红制作www.ecit.edu.cn2007/5（2）是遗传工程的理想受体能够直接摄取外源DNA，细胞器甚至微生物。Isolatedprotoplastarecapableofing

4、esting"foreign"materialintothecytoplasm.Thismaterialincludestheintroductionofnuclear,chloroplasts,mitochondria,DNA,plasmids,bacteriaandviruses.原生质体也具有全能性原生质体是分子水平和细胞水平上研究遗传信息动态的结合点。陈传红制作www.ecit.edu.cn2007/5（3）理论研究细胞壁再生、细胞膜离子转运、病毒侵染。因为细胞壁不仅具有保护功能，还参与细胞的生长和分化等生命活动。必须指出：原生质体必须再生出细胞壁才能继

5、续发育。陈传红制作www.ecit.edu.cn2007/5二、原生质体分离（一）分离方法机械法：利刃机械切割酶解法：果胶酶和纤维素酶处理陈传红制作www.ecit.edu.cn2007/51、机械分离（Machanicalisolation）Cutplasmolyzedtissueandsubsequentdeplasmolysisresultsinexpansionandreleaseoftheprotoplastsfromthecutendsofthecell.Inpracticethistechniqueisdifficultandtheyieldofv

6、iableprotoplastsismeager.Oneadvantage,however,isthatthedeleteriouseffectsofthewall-degradingenzymesonthemetabolismoftheprotoplastsareeliminated.高度液泡化的细胞陈传红制作www.ecit.edu.cn2007/52、酶解分离（Enzymaticisolation）双子叶外植体/培养细胞单子叶植物胚性细胞2.1材料应选择生长旺盛的植物体幼嫩部分。叶肉细胞分离原生质体，来源方便，有明显的叶绿体，便于在融合中认识。但禾本科叶肉

7、原生质体往往不能分裂,因此常采用悬浮细胞作为分离原生质体的材料，最适宜的细胞是处于对数生长早期的细胞。陈传红制作www.ecit.edu.cn2007/52.2酶的种类和浓度纤维素酶（Cellulase）OnozukaR-10果胶酶（Pectolyase）Y-23半纤维素酶（Hemicellulase）对幼叶来说，酶浓度较低：0.5％-1％纤维素酶，果胶酶(0.2％-0.5％);酶量少对愈伤组织、悬浮细胞：纤维素酶、果胶酶的浓度要提高到1％或2％。酶量大酶液PH值：5.4-5.8因为PH高，酶活性低；PH低，原生质体损坏多陈传红制作www.ecit.edu.cn

8、2007/52.3酶液渗