植物原生质体培养和细胞融合

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1、第十章植物原生质体培养和细胞融合10.2原生质体融合10.1植物原生质体培养主要内容原生质体（protoplast）：是去除细胞壁的裸露植物细胞。原生质体培养再生植株技术是细胞融合（cellfusion）和体细胞杂交（somaticcellhybridization）基础。第一节植物原生质体培养一、设备与工具除了需要组织培养的设备和工具之外，还需要一些用具。1、倒置显微镜荧光显微镜反照相设备普通显微镜：原生质体或细胞培养密度（采用血球计数板）倒置显微镜：观察培养皿、培养瓶或滴瓶中的培养物荧光显微镜：检查原生质体活性及去壁情况2、细菌过滤器

2、0.45m的滤膜可以滤去细菌和病毒（1）可用抽滤瓶接真空泵抽滤灭菌（2）可用注射器推压过滤灭菌3、离心机提纯原生质体500r/min离心3-5min制备酶液用2500r/min离心10min二、化学试剂1、无机化学试剂：分析纯2、有机化学试剂：●维生素：组织培养常用的维生素以外还需泛酸钙，叶酸，VA，VC，VD，生物素，氯化胆碱，对甲基苯甲酸●激素：生长素和细胞分裂素的适当搭配●渗透压稳定剂：糖醇系统（甘露醇，山梨醇，葡萄糖，蔗糖）●碳源和氮源：C源：葡萄糖和蔗糖；N源：水解酪蛋白，谷氨酰胺，甘氨酸，Arg，Asp3、凝胶剂：琼脂粉、琼脂糖

3、、日本的GelloanGum三、酶类纤维素酶：日本的CellulaseonzukaR–10CellulaseonzukaRs美国Cellulysin果胶酶：日本的PectolyaseY23Macerozyme美国Pectinase四、原生质体的分离与纯化1、外植体的选择●生长旺盛的植物体幼嫩部分●外植体有根、下胚轴、幼叶、子叶●选择处于对数生长早期的细胞或愈伤组织●酶解游离原生质体之前对植株进行预处理（暗处理、低温处理、组培的培养基上培养）2、外植体灭菌：跟组培一样3、酶处理静置在黑暗中进行时间：几小时到十几小时温度：25-27℃4、原生质

4、体的收集和纯化收集：用40-100m的滤网过滤混合液，将滤液以台式离心机75-100g离心3-5min。纯化：●沉淀物重新悬浮于清洗培养基中，在50g离心3-5min后再悬浮，如此反复洗涤2-3次。●为了纯化出有活力的原生质体，将沉淀悬浮于少量清洗培养基，置于含有蔗糖溶液（21%）的上部，在100g下离心5-10min后，在蔗糖溶液和原生质体悬浮培养基的界面上会出现一个纯净的原生质体带，将此带吸收后，再反复洗涤2次，最后用原生质体培养基洗一次。五、原生质体培养1、培养基●D2a（适用于茄科、玄参科、豆科、藜科）●D2b（除去D2a培养基中的

5、葡萄糖并及时补充蔗糖）一般情况下：无机盐的大量元素含量稍低，钙离子含量较高，采用有机氮源而少用铵盐激素：1-2mg/l2.4-D或配以浓度0.2~0.5mg/l玉米素2、培养方法（1）液体培养§微滴培养：将悬浮的密度为10000~100000个/ml原生质体的培养液用滴管以0.1ml左右的小滴一滴一滴地接种到培养皿上，如果将培养皿翻转过来，则成为悬滴培养。§浅层培养：将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层。（2）固体培养：原生质体悬液体+热融的含琼脂的培养基在45℃下等量混合。（3）固液体混合培养：在培养皿底部先铺上一层琼脂培养基，待固化

6、后，在固体培养基表面再作浅层液体培养。3、培养条件●保持湿度是培养的关键因子●各种植物原生质体要求不同的最适温度，一般可在25℃上下。在光照方面，多数原生质体适合在暗淡的散射光下或黑暗中生长。●原生质体培养要求有较高的密度，具体密度因植物材料、物种及基因型不同而异。●原生质体培养了一段时间后，要添加新鲜培养基，并且通过用较低渗透压的细胞培养基代替，以便适应新细胞团或愈伤组织的生长。4、原生质体的发育原生质体在适合的条件下，首先形成新的细胞壁，继而进行分裂，形成愈伤组织。5、原生质体植株再生途径：（1）将原生质体再生的愈伤组织直接转移到分化培养

7、基上，一步成苗。（2）先将愈伤组织培养在含细胞分裂素和低浓度2.4-D的分化培养基上，形成质地较硬的胚性愈伤组织或胚状体，再将其转到含细胞分裂素的分化培养基上再生植株。第二节原生质体融合（体细胞杂交）一、细胞融合的方法۝自发融合（SpontaneousFusion）：在溶解细胞壁过程中，有些原生质体能彼此融合形成同核体。۝诱导融合（inducedfusion）：用物理或化学的方法来诱导原生质体的融合。步骤：两个或多个原生质体的质膜彼此靠近，局部区域质膜紧密粘连，彼此融合，融合完成，形成球形的异核体或同核体。融合方法：1）物理方法（电融合）2）

8、化学方法●NaNO3处理（异核体形成频率不高）●高pH-高钙处理方法：pH在10.5、50mmol/LCaCl2•H2O37℃处理原生质体（杂种产量高，但对细胞有毒