小麦原生质体培养

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1、小麦原生质体培养赵天琦1009034201生物工程（飞班•实验课题的目的1)通过实验课题学习原牛质体的培养方法。2)熟悉并掌握原生质体培养的实际操作。3)在实际操作中客观具体的了解原生质体培养的全过程。二.材料准备1)小麦愈伤组织的诱导和继代培养成熟种子脱去外壳后，将得到糙麦置于70%的乙醇中搅搬3min,然后取出麦粒用无离子水冲洗干净，之后用10%的安替福民消毒20min,最后用无离子水冲洗三次。将吸干表面水份的麦粒接种在MS+2mg/L2,4-D+3%蔗糖的培养基上，27°C暗培养。15〜20天后将新形成的愈伤组

2、织从母体上切下，转入MS+lmg/L2,4-D+O.5mg/LBA+lmg/LNAA+3%蔗糖的培养基中继代培养。2)悬浮细胞系的建立可采用一步法和两步法建立悬浮细胞系。一步法是指将幼胚或成熟胚直接放入液体培养基中进行悬浮培养；两步法即成熟胚在固体培养基上培养10〜15天后，将诱导产生的小愈伤细胞团连同母体，接入液体培养基中进行悬浮培养。培养温度为27°C,振荡速度为12（k/min,液体培养基采用AA培养基或N6+1.5mg/L2,4-D+0.2mg/L玉米素+2g/L脯氨酸培养基。初期7〜10天继代1次，以后5~

3、7天继代1次,待悬浮系基本建成后，3〜4天继代1次。原生质体分离取已建立的悬浮细胞系lg左右，放入lOmLCPW盐配置的混合酶液中，酶液组成为2%纤维素酶RS+O.1%果胶酶Y-23+5mmol/LMES+O.5mol/L廿露醇，pH5.6,放在平台摇床上（60i7min）温育3〜4h,直至原生质体完全释放到酶液中。原生质体纯化酶解完成后，用孔径为60um的金属网过滤酶解混合物,滤去未被酶解的残留物。然后将原生质体与酶液混合物转移到离心管中，在50g离心力下离心5min,收集原生质体，再用培养基洗2次，以去掉残留的酶

4、液。五.原生质体培养小麦原生质体的培养基通常采用KPR培养基。先将原生质体的培养密度调整为（0.5-1.0）X1（T5个/mL。然后可以进行液体浅层培养、琼脂糖包埋培养和固-液双层培养。固-液双层培养的具体操作为在60mmX5min的培养皿内，先放入ImL含1%琼脂糖的原生质体培养基，待其冷却凝固后，再加入含有适当密度的原生质体液体培养基0.5~0.7niL。将培养皿用封口膜封口后培养。六.体细胞胚的诱导与植株再生当原牛•质体能够形成肉眼可见的小愈伤组织时（一般需4〜5周的时间），将直径1〜2mm的愈伤组织转移到蔗糖

5、含量为8%的N6基本培养基上诱导体细胞胚胎的发生。转移后大约15天左右有部分愈伤组织分化出具有盾片和胚芽鞘的胚状体，然后进一步萌发为小植株。七.课题总结对实验课题进行记录总结，对实验中出现的不正常现象进行分析汇总并找出原因。