原生质体培养ppt课件

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1、第八章原生质体培养目的与要求掌握植物细胞原生质体培养的意义，了解原生质分离方法，原生质纯化方法和活力测定方法。掌握植物原生质体的培养方法及其特点，以及存活率、密度、产量的测定方法。掌握原生质体融合概念、介绍原生质体融合方法，了解杂种细胞的筛选、鉴定和杂种植株的鉴定方法。具备原生质体分离、纯化基本认知，具有原生质体培养基本能力，能够理解原生质体融合概念及方法。原生质体：原生质体去掉细胞壁的由质膜包裹着的裸细胞。一、原生质体概念1、原生质体没有细胞壁，有利于细胞融合，体细胞杂交，基因转移和单细胞培养。2、原生质体能比较容易摄取外来的遗传物质，

2、作为理想的受体系统进行各种遗传操作的研究，实现体细胞杂交在植物遗传育种方面的应用。二、原生质体培养意义：一、原生质体的分离（一）植物细胞壁的结构及其化学组成1、植物细胞壁：初生壁：纤维素、半纤维素、果胶次生壁：纤维素、半纤维素2、相邻细胞的初生壁间有中层（胞间层）：果胶酸钙、果胶酸镁果胶化合物是一种可塑性大且高度亲水的交替，可使相邻细胞粘在一起，并有缓冲作用。第一节原生质体的分离与纯化（二）降解细胞壁的酶类用于植物原生质体分离的酶类：纤维素酶：半纤维素酶：果胶酶：（三）材料来源1、来源叶片，花瓣，果实组织，花瓣髓部，子叶等，尤其是叶肉细胞

3、及由各部分形成的培养细胞和悬浮细胞。2、预处理1）低温处理2）等渗溶液处理1、机械分离法产生质壁分离——释放原生质体缺点：原生质体的产量很低；方法繁琐费力；因必须高度质壁分离，故局限性大。优点：能够排除外加酶对离体原生质体的结构和代谢活性的有害影响。（四）分离方法2、酶分离法收率高、活力强、完整性好。分离原生质体最有效。（1）酶的种类及特点分离原生质体的酶多是一些复合酶制剂，以其所含的主要酶的作用分为：1、纤维素酶类2、半纤维素酶类3、果胶酶类4、崩溃酶5、蜗牛酶（2）酶液的配制1、酶的配比和浓度2、渗透压和稳定剂及PH。（3）分离原生质

4、体1、两步分离法。用果胶酶离析植物组织，收集细胞，经洗涤后用纤维素酶解离细胞壁，然后获得原生质体。2、一步分离法。一定量的纤维素酶和果胶酶组成混合酶液，对材料进行一次性处理。叶肉原生质体分离纯化纯化后的叶肉原生质体1、沉降法（过滤离心法）：低速离心使原生质体沉于底部。2、漂浮法：根据原生质体和细胞或细胞碎片的比重不同，分离出原生质体。3、不连续梯度离心法：在离心管中首先放入不同浓度的Ficoll溶液，构成不同梯度，在上部滴入1-2ml酶—原生质体混合液，在150g离心5min，不同比重的原生质体漂浮在不同的浓度梯度的界面上，用吸管手机原生

5、质体，悬浮洗涤备用。二、原生质体的纯化1、荧光素二乙酸法2、染色识别用0.1%酚番红或Evans蓝进行染色。3、形态识别形态上完整，含有饱满的细胞质，颜色新鲜的原生质体即为存活的。三、原生质体活力的测定1、供试材料一般选用继代后处于旺盛分裂时期的淡黄色、颗粒状的愈伤组织、悬浮细胞系或生长健壮植株上的较幼嫩外植体。2、酶的种类、组合和酶解时间选择纯度高的酶类，根据酶解材料细胞壁的特性及酶活性大小确定适宜的酶液组合。酶浓度不宜过高，酶解时间不宜过长，最好不超过8h。木本植物细胞壁成分坚厚，半纤维素较多，适当添加半纤维素。四、影响原生质体数量和

6、活力的因素3、渗透压稳定剂主要有两类：一类由糖醇或可溶性糖组成的有机溶液，目前大多采用这一类，一般使用甘露醇或山梨醇，也有的使用蔗糖，使用甘露醇者最多。一类是无机盐类，由氯化钙、硫酸镁、氯化钾或培养基中的无机盐组成。优点是原生质体的产量高，缺点是可降低细胞壁降解酶的活性，使高浓度的无机盐进入细胞内，从而影响培养效果。四、影响原生质体数量和活力的因素4、质膜稳定剂为了提高质膜的稳定性和增加原生质体的产量，可在酶液中添加多聚阳离子和无机钙离子作为质膜稳定剂。一般添加0.5%-1.0%的葡聚糖硫酸钾或0.1%氯化钙。四、影响原生质体数量和活力的

7、因素5、PH酶液的PH对原生质体的产量和活力影响很大，因植物材料不同要求也不同，一般为5.5-5.8。如原生质体的供体材料是植物器官，酶液中应加入PH缓冲剂，以维持稳定酶液的PH，一般添加0.05-0.1%磷酸盐或3.0-5.0mmol/LMES.四、影响原生质体数量和活力的因素一、培养基1、碳源：葡萄糖2、氮源：谷氨酰胺3、生长物质：生长素与细胞分裂素4、钙源：可增强稳定性，提高分裂频率，明显改变细胞质内外的离子交换。5、渗透压：高渗溶液，培养时一般逐步过渡，通常的渗透剂是甘露醇和山梨醇。6、PH5.6～6.0，醋酸纤维微孔滤膜过滤灭菌

8、第二节原生质体培养二、培养方法1、液体浅层培养原生质体（约2×105/ml密度）悬浮在液体培养基—将悬浮物质移到直径为60cm的平皿中（2-3mm为宜）—5-10天后开始原生质体分裂特点：通气