《原生质体融合育种》ppt课件

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1、第一节微生物原生质体育种原生质体：1953年首次用巨大芽孢杆菌制备成功1955年发现再生方法微生物原生质体的特点：对渗透压特别敏感对诱变剂的诱变效应更敏感失去对噬菌体的敏感性不受感受态的影响第一节微生物原生质体育种一、原生质体再生育种二、诱变育种三、转化育种四、融合育种五、其他微生物原生质体育种一、原生质体再生育种~：微生物制备原生质体后直接再生，从再生菌落中分离筛选变异株，最终得到优良性状提高的正变菌株原生质体再生育种正变率高于常规育种？制备和再生过程中相关因素微生物组成和结构改变一般选用对数期细胞制备原生质体不需要加遗传标记第一节微生物原生质体育种一、原生质

2、体再生育种出发菌株选择菌种活化和预培养原生质体制备原生质体再生高产菌株分离二、原生质体诱变育种微生物制备原生质体后诱变处理，分离到再生培养基中再生，从再生菌落中分离筛选高产正变菌株二、原生质体诱变育种操作：物理诱变剂化学诱变剂特点：操作繁琐、技术要求高再生时间长、容易染菌P223扩展青霉PF-868原生质体诱变第一节微生物原生质体育种三、原生质体转化育种何种形式DNA转化率高？质粒第一节微生物原生质体育种五、其他微生物原生质体育种脂质体转移原生质体转染等第二节微生物原生质体融合育种微生物原生质体融合育种：通过人为方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，并

3、产生重组子的过程。聚乙二醇诱导电场诱导微生物原生质体融合育种的优点？1、大幅度提高亲本间重组频率2、扩大重组的亲本范围3、集中双亲本优良性状机会更大第二节微生物原生质体融合育种微生物原生质体融合育种程序（见图9.2）14原生质体融合技术的一般步骤融合亲本的选择与标记；原生质体的制备；原生质体的融合；原生质体的再生；融合子的选择与鉴定；目标菌株的筛选。一、直接亲本及其遗传标记的选择1.营养缺陷型、抗性标记、热致死孢子颜色、菌落形态等注意：多数营养缺陷型菌株会影响代谢产物的产量2.常把一方灭活后再融合3.可用不同荧光标记直接亲本3.可用不同荧光标记直接亲本提取拟南芥

4、叶片的原生质体，并转化带有GFP标签的目的蛋白表达载体，瞬时表达观察目的蛋白在亚细胞中的定位情况红色为叶绿体自发荧光绿色为GFP的荧光。二、原生质体制备与再生制备过程：分离、收集、纯化、活性鉴定、保存去壁方法：1.机械法2.非酶分离法3.酶法酶法分离原生质体：参考图9.3第二节微生物原生质体融合育种酶法分离原生质体的影响因素？（1）培养基组成放线菌加入亚适量甘氨酸黑曲霉第二节微生物原生质体融合育种酶法分离原生质体的影响因素？（2）菌体培养方式：1.平板玻璃纸法：丝状菌2.振荡沉没培养法细菌和酵母菌酶法分离原生质体的影响因素？（3）菌体年龄丝状真菌菌丝体尖端细胞放

5、线菌对数期到静止期细菌对数期酵母菌菌体同步化酶法分离原生质体的影响因素？（4）稳定剂高渗溶液无机盐：NaCl、KCl、MgSO4、CaCl2有机物：蔗糖、甘露醇、山梨醇丝状真菌无机盐细菌蔗糖、氯化钠稳定剂常用浓度：0.3~1mol/L（５）酶解前的预处理加入某种物质，抑制或阻止细胞壁某种成分合成酵母菌、丝状真菌巯基乙醇酵母菌EDTA放线菌甘氨酸细菌亚适量青霉素酶法分离原生质体的影响因素？（６）酶系和酶的浓度细菌、放线菌　　　溶菌酶真菌　　　蜗牛酶注意事项：酶法分离原生质体的影响因素？（７）酶的作用温度和ｐＨ值酶的最适温度、菌株生长最适温度（８）菌体密度酶法分离原

6、生质体的影响因素？（９）酶解方式使用培养皿分离效果好分离时保持良好的通气条件、适当振荡分离条件经试验可确定如计算测定原生质体形成率第七节微生物原生质体融合育种如何计算测定原生质体形成率？原生质体形成率=（A-B）/A×100%细菌、酵母菌血球计数板计数法高渗再生培养基培养法霉菌、放线菌高渗再生培养基培养法二、原生质体制备与再生２．原生质体的鉴定（１）低渗爆破法p233（２）荧光染色法荧光增白剂荧光显微镜二、原生质体制备与再生３．原生质体的收集和纯化（１）过滤法　　　　　适于丝状微生物（２）密度梯度离心法离心后，原生质体上浮（３）界面法　离心后，原生质体在界面（４

7、）漂浮法　　适于细胞较大的微生物二、原生质体制备与再生４．原生质体的活力测定（１）荧光素双醋酸盐染色法（２）酚藏花红染色法（３）伊文思蓝染色法二、原生质体制备与再生５．原生质体的保存液氮冷藏加入保护剂，如：二甲亚砜、甘油等二、原生质体制备与再生原生质体的再生：在高渗再生培养基上，原生质体重新合成细胞壁，恢复成完整细胞。参见p234图9.41.原生质体再生的影响因素（ｐ234）菌体生理状态稳定剂酶浓度和作用时间再生培养基组成残存菌体的分离；再生培养基上冷凝水原生质体密度、再生方法二、原生质体制备与再生２．再生率及其计算p236目的：找出最佳的原生质体制备和再生条件

8、再生频率（%）=[（C-