原生质体融合

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1、一、原生质体分离二、原生质体分离及纯化操作三、原生质体培养四、体细胞杂交（原生质体融合）五、原生质体的遗传饰变第三节、植物原生质体技术及应用体细胞杂交研究历程及一般概念体细胞杂交的一般流程杂交细胞的鉴定123细胞杂交的应用4（一）体细胞杂交的含义及研究历程概念：不同亲本（种间或属间等）的原生质体，在人工诱导下，相互接触，从而发生膜融合、胞质融合、核融合并形成杂种细胞，经过培养进一步发育成杂种植株。这一过程称为原生质体融合或细胞杂交。◆使植物无性杂交成为可能◆使有性杂交根本无法获得的种间、属间、科间远缘杂种成为现实◆打破了物种间的界

2、限原生质体融合的意义植物体细胞杂交的几个重要进展1960年Kocking用酶法制备高等植物原生质体首次获得成功；1971年Takebe首次从离体烟草原生质体培养中获得再生完整植株；1972年Carlson首次获得粉蓝烟草和郎氏烟草的细胞杂种，这是第一个植物体细胞杂种；1974年Kao将聚乙二醇（PEG）诱导融合法应用于植物细胞融合并建立了相应的融合技术；1978年Melchers获得第一个属间体细胞杂种（番茄＋马铃薯）；1981年Zimmerman发明了电融合仪，并首次提出了电融合概念；1987年Schweiger建立了单对原生质

3、体电融合技术程序。（二）植物细胞融合的程序：◆原生质体分离的分离、纯化◆融合方法选择◆杂种细胞的筛选◆愈伤组织形成、分化植株再生◆杂种植物的鉴定原生质体融合的方法聚乙二醇PEG）化学方法电脉冲物理方法生物方法仙台病毒(Sendaivirus)NaNO3处理高pH-高浓度Ga2+飞秒激光诱导融合电融合空间细胞融合（1）电融合法：指利用改变电场诱导原生质体彼此相连成串，再施以瞬间强脉冲电压促使质膜发生可逆性电击穿，达到原生质体融合的方法。◆电融合特点：效率高对原生质体伤害性小对融合细胞数易于控制方法：微电极法和双向电泳法双向电泳法：通

4、过电泳，两细胞膜紧密接触，且膜表面的蛋白质分子分离，产生了无蛋白的类脂区。电融合仪Fusionphasesofoat（燕麦）protoplasts(Avenasativa)微电极法：指利用改变电场诱导原生质体彼此相连成串，再施以瞬间强脉冲电压促使质膜发生可逆性电击穿，达到原生质体融合的方法。实际操作：先把待融合的细胞或原生质体混合，取样置于100V/cm的高频交流电场中，在非均匀交流电场中形成项链状排列；完整烟草原生质体（40×）原生质体成串（40×）微电极法：再用1~5V/cm直流电脉冲/微秒冲击细胞或原生质体的粘接点，细胞膜降

5、解造成若干微孔，于是在膜之间形成通道，使细胞质得以交换；最后导致新的球状细胞的形成。1、原生质体在诱融剂或正弦电场作用下凝集，彼此靠近；2、两个相邻原生质体之间的质膜相互融合，随后两个亲本原生质体质膜上的受体、糖蛋白、糖脂等成分也在融合后的质膜上重新分布；3、细胞质发生融合；4、细胞核发生融合，形成单核融合细胞。融合过程：（2）聚二乙醇诱导融合法◆PEG融合的机理：PEG分子具有轻微的负极性，与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成氢键。当PEG分子链足够长时，它在相邻原生质体表面之间有分子桥、改变膜表面物理化学性质和增加类

6、脂膜流动性作用，引发原生质体的粘连。当PEG分子被洗脱后，膜上的电荷便重新分布，从而导致原生质体融合。PEG的选用：一般选择相对分子质量为4000获6000PEG对细胞有毒害作用，用离子交换树脂纯化可消除其对细胞的毒害作用。优点：成本低、不需要特殊的设备；融合子产生的异核率高；融合过程不受物种限制缺点：融合过程繁琐、PEG可能对细胞造成毒害PEG融合所需试剂融合液：pH5.6CaCl22H2O8~10mmolKH2PO40.7mmol甘露醇或山梨醇0.5~1.0mol诱导液：融合液＋PEG20～45％稀释液：A液（g/100ml）

7、pH6.0B液(g/100ml)pH10.5葡萄糖7.21甘氨酸0.375CaCl22H2O0.79NaOH0.169P1P2P1P2混合静止1min.融合融合液加入PEG稀释洗涤加入稀释液加入培养基培养选择PEG法的流程P1P2P1P2融合融合液稀释洗涤培养选择盐类融合剂种类硝酸盐类：NaNO3、KNO3、Ca(NO3)2氯化物类：NaCl、CaCl2、MgCl2、BaCl2葡聚糖硫酸盐类：葡聚糖硫酸钾、葡聚糖硫酸钠盐类融合的优缺点优点：盐类融合剂对原生质体的活力破坏力小缺点：融合频率低，对液泡化发达的原生质体不易诱发融合（3）

8、盐类融合法（4）高Ca2+和高pH值融合Ca2+浓度0.05mol/LpH9.5-10.5取分离、纯化好的两种亲本原生质体以1:1的比例混合;加入0.05mol/LCaCl2.2H2O和0.4mol/L甘露醇;再用甘氨酸钠缓冲调节pH值到10.5，