原生质体的分离与融合

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1、原生质体的分离与融合什么是原生质体原生质体，是指出去细胞壁的植物细胞的部分。由Hanstein1980年提出在适当条件下，原生质体可以成功培养长出细胞壁，并通过细胞分裂。原生质体不仅对细胞融合研究有价值，且能通过裸露的质膜获得外源DNA、细胞器、细菌和病毒颗粒等。一、原生质体分离原生质体分离的基本原则是保证原生质体不受伤害并不损害其再生能力。1.机械法只有储藏组织中较大的、高度液泡化的细胞才能用于分离原生质体，如洋葱球茎鳞片、萝卜根、甜菜根等；缺点：产量低；方法枯燥无力；因破碎细胞释放物的存在，原生质体活力

2、低。2.酶法Cocking在1960年证实了可用酶分离原生质体。Takabe等1968年首次用商业酶试剂分离原生质体，并在1971年获得再生植株。缺点是：不纯酶制剂所含的杂质可能会对原生质体产生不同程度的毒害作用。原生质体的分离二、影响原生质体分离的因素原生质体分离时主要考虑取材、酶的种类、纯度、酶液的渗透压、酶解时间、温度等。1组织和细胞材料的生理状态植物幼苗或新生枝的完全伸展叶片的叶肉组织是分离原生质体的最方便、最合适的植物材料。叶肉细胞排列松散，酶试剂很容易达到细胞壁。用于分离原生质体的愈伤组织或悬浮

3、细胞应当处于生长早期或指数生长期。采用愈伤组织或悬浮细胞，采用其材料可以避免植株生长环境的不良影响，可以常年供应，易于控制新生细胞的年龄，处理时操作方便，无需消毒。二、影响原生质体分离的因素2酶纤维素和半纤维素是细胞壁的初生结构和次生结构的成分，果胶类物质是连接细胞胞间层的成分。纤维素酶（降解构成细胞壁的纤维素）、半纤维素酶、果胶酶（使细胞从组织中分开，以及细胞与细胞分开）酶活性与pH有关，4.7~6.0，温度一般在25~30℃二、影响原生质体分离的因素3渗透剂原生质体直接释放到培养基中会破裂，因此，在分离

4、原生质体期间，须对原来细胞壁机械维持压力用原生质体分离混合液以及后来培养基的适当渗透压代替。在合适的渗透压溶液中，刚分离的原生质体看起来是球状的。二、影响原生质体分离的因素4原生质体的纯化酶消化后得到的混合物含有亚细胞碎片、未消化的细胞、破碎的和完整的原生质体。可通过对此混合物通过过滤、离心、漂洗联合的方法进行纯化。1）收集：原生质体混合液用滤网（40~100μm）去掉没有降解的细胞及组织，收集滤液。2）洗涤：将网下物低速离心，去掉上清液，再加无酶液的CPW液悬起起原生质体，再离心，弃上清，重复几次即可。3

5、）纯化（上浮法和下沉法）上浮法是将酶解的原生质体与蔗糖溶液（23%左右）混合。下沉法是讲原生质体与13%的甘露醇混合，然后加到23%的蔗糖溶液顶部，形成一个界面。两种方法中，均在离心5~10分钟后，在蔗糖溶液顶部形成一条原生质体带。用吸管将带轻轻吸出来，悬浮离心，稀释后用于培养。二、影响原生质体分离的因素5原生质体的活力测定和密度原生质体的真正活力使原生质体有能力通过持续有丝分裂，再生成愈伤组织，并最终再生成植株。测定原生质体活力的方法主要有：FDA（荧光素二乙酸）染色法；酚藏红花（CFW）染色法；测定呼吸

6、强度法等。影响原生质体分离的因素6培养基成分培养基中应当去除铵，因为它对原生质体的生存是有害的，而铁、锌的含量也应当减少。另外，钙的浓度应当比通常培养细胞所需的浓度增加2~4倍，提高钙的浓度能改善膜的稳定性。葡萄糖是最好最可靠的碳源，其次为蔗糖。7环境因子一般来说，刚开始培养时高光强会抑制原生质体的生长，因此应先在黑暗或弱光下培养几天，再将其转移到一般光强下培养。温度范围20~28度适宜，pH范围5.5~5.9适宜。三、原生质体培养原生质体培养1.液体浅层培养（Liquidthinlayerculture）

7、原生质体纯化后，将原生质体悬浮于液体培养基中，取少许于培养皿底部形成很薄的一层，封口培养。2.固体培养（Solidculture）也叫琼脂糖平板法或包埋培养法。将原生质体悬浮于液体培养基后，与凝固剂（琼脂或琼脂糖）按一定比例混合，在培养皿底部形成一薄层，凝固后封口培养。3.固液双层培养法（Solidoverliquidculture）即先在培养皿底部铺一层固体培养基，待凝固后再在其上进行液体浅层培养。固体培养基中的营养成分可以被液体层中的原生质体吸收利用，而原生质体产生的有毒物质可以被固体培养基吸收。细胞再

8、生（1）细胞壁形成不同植物原生质体再生细胞壁所需时间不一样，从几小时到几天。原生质体失去其圆球形特征表明了新细胞壁的再生。简单鉴别壁再生的方法是用荧光增白剂（CFW）染色法检测到。（2）细胞分裂第一次细胞分裂一般发生在2~7d内，分裂活跃的细胞悬浮培养的原生质体与叶片高度分化细胞的原生质体相比，前者进入第一次细胞分裂较快。（3）植株再生具有再生能力的原生质体就会不断分裂形成多细胞团。当细胞团进一步发育成为肉眼可见