原生质体无菌分离培养与融合

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1、植物原生质体的分离，培养与融合了解植物原生质体分离、融合和培养的基本原理及其过程。植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”，是开展基础研究的理想材料。其中酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁。许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主质体融合，现在被广泛采用并证明行之有效的融合方法是聚乙二醇(PEG)法，高Ca高pH法和电融合法。PEG诱导融合的机理：PEG由于含有醚键而具负

2、极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键，当PEG分子足够长时，可阼为邻近原生质表面之间的分子桥而使之粘连。实验器具材料灭菌：超净工作台，酒精灯，解剖刀，长短镊子，烧杯（4个），玻棒，滤纸若干张，培养皿（1个）酶液抽滤灭菌：过滤用注射器（1个），滤头，0.25um滤膜（*4套）培养基和高压灭菌：高压灭菌锅，带盖培养瓶（*4）培养：离心机；200目滤网和过滤用漏斗（*1）；带盖离心管（×3）；封口膜；移液枪；培养皿（*3）；1ML枪头1盒；胶头滴管（4个）（胶头部分70％的酒精浸泡；倒置

3、显微镜；培养箱实验试剂70％的酒精3％的次氯酸钠(体积比）酶液：1.0％的纤维素酶和0.8％的果胶酶，用13％的CPW配制20％蔗糖溶液CPW洗液以及含13％甘露醇的CPWMS母液的配置（见细胞生物学实验98页），有机质母液装棕色试剂瓶，其余装普通试剂瓶，储存冰箱备用。生长素：2.4－D(1mg/ml)，称取20mg,先用95％的酒精溶解，然后定容至20ml细胞分裂素：6－BA（0.5mg/ml），称取10mg,先用1M盐酸溶解，然后定容至20ml培养基的配制：MS＋2.4－D(1mg/L)+6－BA

4、（0.5mg/L）+20%（体积重量比）的蔗糖，按照所需体积，依照母液浓缩倍数，定容培养基。需要灭菌的东西1.抽滤灭菌：酶液2.高压灭菌：培养基(带盖培养瓶装)，无菌水（用酒精瓶装，盖上刺小孔），20％的蔗糖，13％的CPW3器具灭菌：材料灭菌：解剖刀，长短镊子，烧杯（4个），玻棒，滤纸若干张，培养皿（1个）酶液抽滤灭菌：过滤用注射器（1个），滤头，0.25um滤膜（*4）原生质体纯化：200目滤网和过滤用漏斗（*1）；带盖离心管（×3）；培养皿（*3）；1ML枪头1盒；胶头滴管（4个）（胶头部分70

5、％的酒精浸泡）原生质体的酶解与分离（无菌条件）叶片表面消毒用清水洗涤叶片，吸去叶表面水分，然后将叶片移入无菌室，在70%乙醇液内浸数秒钟，取出后立即放人3%次氯酸钠溶液10分钟，最后用无菌水冲洗3-4次。酶解：将表面灭菌的叶片撕去下表皮，放入盛有5毫升酶液的培养皿中，让去除下表皮的一面接触酶液，铺满一层，在室温下酶解3-4小时。用350目网过滤除去未完全消化的叶片等残渣。在1000rpm条件下离心5分钟，弃上清液，加入3～4ml13%CPW洗液，相同条件下离心，弃上清液。加1ml13%CPW洗液悬浮。

6、**蔗糖漂浮方法：（1）用细口吸管吸20%蔗糖溶液4ml加入另外一支离心管底部，然后将原生质体的悬液小心加在蔗糖界面上。由于比重不同，蔗糖溶液与原生质体悬液中间有一明显界面(注意要有明显界面).(2)1000转/分离心5分钟，此时死细胞及碎片降至蔗糖溶液内，聚集在离心管底部，而活细胞由于有大量泡沫，故漂浮在上下界面处，(3)用细管吸取漂浮在上下界面处的健康原生质体，转入干净的离心管中，加入3～4ml13%CPW洗液离心收集沉淀，用13%CPW的CPW重新悬浮。原生质体培养将无菌收集的原生质体加入培养皿

7、中，添加5ML培养基，封口膜封口，25度黑暗培养，1天后观察是否污染和2－3天后观察是否分裂。细胞融合（有菌条件）加原生质体0.3ML与带盖离心管中，另加入0.15ML40%PEG液，30℃水浴中温浴15min；融合液一滴于载玻片上(注意保持一定湿度，不能太干)，轻轻盖上盖玻片，显微镜观察。用光学显微镜或倒置显微镜(高倍)观察2-3个细胞靠近或融合的过程。（观察时注意不同程度的融合现象。通常分为五个阶段。①两细胞膜接触，粘连；②细胞膜形成穿孔；③两细胞的细胞质连通；④通道扩大，两细胞连成一体；⑤细胞完

8、全合并，形成一个含有两个或多个核的圆形细胞。）