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1、高山红景天叶肉原生质体分离培养与植株再生小组成员：张亚琴赵校玲祝志诚赵鑫张可建朱晓兰曾娟张静静张运浩章登华7/25/20211目的：利用高山红景天组培苗叶片分离得到原生质体，经培养后获得再生植株。方法：研究外植体前期预处理、外植体的大小、酶液配比、酶液中甘露醇浓度等影响原生质体的相关因素，确定最优条件。7/25/20212高山红景天7/25/20213高山红景天人工栽培利用的研究高山红景天7/25/20214高山红景天：为景天科红景天属多年生草本植物，是长白山珍稀药用植物之一，具有抗缺氧、抗寒冷、抗疲劳、抗微波辐射等显著功能。7/2
2、5/20215一材料和方法1.材料高山红景天组培苗叶片7/25/202162.原生质体分离：取材：幼嫩叶片(长0.5～3）切成宽1.0～2.0mm的条状酶液配制：0.5%～2%纤维素酶+0.3%～1%果胶酶+10mmol/LCaCl2·2H2O+0.1%MES+0.7mmol/LKH2PO4+0.4～0.6mol/L甘露醇,pH=5.8酶解处理：以1∶10的量将材料放入酶液。于25℃,黑暗条件下振荡酶解1～5h,转速为80r/min。7/25/202173.原生质体纯化：酶解后的原生质体和酶混合液经250目的尼龙网滤过后以800r/
3、min离心8min沉降原生质体。向沉降的原生质体中再加入洗涤液和液体培养基各清洗1次备用。洗涤液：10mmol/LCaCl2·2H2O+0.1%MES+0.7mmol/LKH2PO4+0.4mol/L甘露醇,pH=5.8液体培养基：1/2MS+1mg/L2,42D+0.5mg/LZT+0.5mol/L甘露醇+500mg/L水解酪蛋白。7/25/202184.原生质体存活率及产量的测定：活力测定:采用EvansBlue染色法，存活率=(未染蓝细胞数/细胞总数)×100%。原生质体产量:用血球计数板进行计数,以每克鲜质量组织获得的原生质
4、体个数(个/g)来表示.7/25/202195.原生质体培养：将原生质体密度调到210×105个/mL,转入原生质体液体培养基中进行液体浅层黑暗静置培养。在培养过程中每10d以3∶1(原生质体培养基∶无渗透压调节剂培养基)比例加入无渗透压调节剂培养基,逐步降低渗透压。7/25/2021106.愈伤培养与植株再生:当多细胞团进一步增大,形成肉眼可见的小愈伤组织时,挑出并转移到愈伤组织培养基MS+6-BA2mg/L+NAA0.5mg/L,转为光照培养之前,首先经过2～3d的弱光培养锻炼阶段,然后转入光照培养,继续培养约1个月时间。经3次
5、继代培养后,挑选鲜绿色愈伤组织转入芽分化培养基MS+1mg/L6-BA+0.1mg/LNAA,待小芽长至2.0cm左右,切下转入生根培养基上形成完整植株,生根培养基为1/2MS。培养基pH=5.8-6.0,琼脂6g/L,蔗糖25g/L,在1.2kg/cm2压力下灭菌20min,培养温度(25±2)℃,光照强度为2000～3000lx,每天光照12h。7/25/202111二、结果与分析7/25/2021121.光照与黑暗7/25/202113结果表明：在相同酶解条件下，光照与黑暗处理对高山红景天原生质体产量间差异不显著，因此，在进行
6、原生质体分离以前，对组培苗是否光照不是影响原生质体产量的关键因素。在此实验中，直接采取没有进行黑暗预培养的组培苗进行原生质体分离。7/25/2021142.叶片大小7/25/202115在相同酶解条件下，长度大于1.5cm的叶片原生质体产量显著高于长度小于1.5cm的处理，因此，选用长度大于1.5cm的叶片为宜。7/25/2021163.酶类组合纤维素酶与果胶酶组合7/25/202117各处理存活率大小顺序为:1>4>5>2>7>3>8>6>9各处理产量大小顺序为:5>3>6>2>7>4>8>1>9综合来看，处理5的产量显著高于其他
7、处理，因此，采用处理5的酶液组合（1%纤维素酶+0.5%果胶酶）可获得最大存活原生质体产量。7/25/2021184.酶解时间与酶液中甘露醇浓度对高山红景天原生质体产量的影响：7/25/202119时间影响：1~4h随酶解时间的延长，原生质体产量递增，在4h时达到最高值，以后随时间的延长，产量下降。酶解后期的产量和存活率下降，是由于酶解液长时间浸泡造成部分原生质体破裂和损伤引起的。7/25/202120酶液中甘露醇对原生质体产量和存活率的影响：酶液中采用0.5mol/L甘露醇的处理经纯化后呈圆球型，可观察到大量叶绿体的存在。因此，酶
8、液采用0.5mol/L的甘露醇用于维持原生质体渗透压效果较好。7/25/202121高山红景天原生质体培养与植株再生：将纯化的原生质体密度调到2×105个/mL,在黑暗条件下进行液体浅层培养，经3天可见第一次细胞分裂，约40d时，可形
