第4章 原生质体培养及融合1

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1、第四章 原生质体技术第一节   原生质体培养1.原生质体分离2.原生质体培养第三节杂种细胞的选择及体细胞杂种植株的鉴定第二节原生质体的融合1植物细胞一般都有细胞壁和原生质体两大部分组成2名词术语：原生质体(protoplast)：指除去细胞壁的细胞或是一个被质膜所包围的裸露细胞。原生质体植物细胞3亚原生质体(subprotoplast)：在原生质体分离过程中，有时会引起细胞中内含物的丢失而形成一些较小的原生质体，称为亚原生质体。它可以具有细胞核，也可以没有细胞核，或是只有1条或少数几条染色体，具体情况有：小原生质体(minipro

2、toplast)：也称核质体(nuclearplast)，具备完整细胞核，但只含有部分细胞质。胞质体(cytoplast)：不含细胞核，只有细胞质。微小原生质体(microprotoplast)：只有1条或几条染色体的情况。4原生质体植物细胞小原生质体（核质体）胞质体细胞膜细胞壁细胞核微小原生质体染色体5原生质体融合：也称为细胞融合或体细胞杂交。是指将植物的不同种、属甚至科间的原生质体，通过人工方法诱导融合，然后进行离体培养，使其再生成为杂种植株的技术。6第一节   原生质体培养一、原生质体培养的发展历史要进行原生质体培养，首先必

3、须分离原生质体，即去除细胞壁，得到完整的裸露细胞。1880年，Hanstein首次提出原生质体(protoplast)一词。1892年，Klercker采用机械法分离原生质体，但效率极低，无法进行培养和再生。1960年，英国诺丁汉大学的Cocking教授首次使用纤维素酶酶解法处理番茄的幼根，获得了大量具有高度活性的原生质体。71968年后，由于纤维素酶、离析酶投入了市场，使原生质体分离技术日益发展和成熟，原生质体培养也开始成为热门研究领域。1971年，Takebe等首次将烟草叶肉原生质体培养成完整植株。1985年，Fujimura

4、等获得第一例禾谷类作物，即水稻原生质体的再生植株。1986年，Spangenberg等由甘蓝型油菜的单个原生质体培养得到再生植株。据统计，目前已有49个科，146个属的320多种植物经原生质体培养得到了再生植株（1993）。其趋势仍以农作物和经济作物为主，但从一年生向多年生、草本向木本、高等植物向低等植物扩展。在果树上，主要集中在柑橘上，在这方面华中农业大学园林学院作了比较多的工作，获得了种间、属间的体细胞杂种。但这些体细胞杂种再生植株在生产上还没有得到应用。8二、原生质体培养的意义1、为细胞融合提供直接方法2、为遗传转化提供新的

5、途径原生质体没有细胞壁，可以直接吸收外源DNA，或通过电击穿孔法、PEG法等方法，将基因导入原生质体，实现遗传转化。3、利用原生质体培养中广泛发生的变异，选育新品种。94、用于细胞器的分离与转移由于原生质体没有细胞壁的障碍，可以进行亚细胞水平的操作研究。如叶绿体、线粒体、细胞核、染色体等的摄取。在摄取细胞器后进行培养，获得再生植株，根据再生植株的表现，即可进行遗传分析，研究某种细胞器的功能或其所控制的性状。也可以通过细胞器的转移，使物种获得相应的性状。105、用于理论研究如细胞壁的生物合成、原生质膜的结构与功能、激素的作用机理、病

6、毒的侵染机理等。原生质体研究已在细胞生物学、生物技术、生理学、遗传学、病理学、病毒学、育种学等领域得到广泛应用。6、用于种质资源保存11再生能力细胞分化个体（胚胎）发生器官发生原生质体系统外源DNA体细胞遗传学细胞生理学细胞融合细胞克隆121、取材：材料的类别对原生质体培养很重要可采用离体培养植株、田间或温室植株，利用其叶片、叶柄、茎段等均可分离原生质体，但一定要选用幼嫩部分。近年来，为了提高原生质体再生的频率，最常用的是以下几类材料：无菌试管苗的叶片上胚轴和子叶处于对数生长期的细胞悬浮系三、原生质体的分离132、酶的种类和作用原

7、生质体分离的效果主要取决于酶的种类和浓度。目前主要使用的酶有：果胶酶类、纤维素酶类、半纤维素酶类和崩溃酶等，有时还会使用蜗牛酶（见下表）。14151）果胶酶类从根霉或黑曲霉中提取，能降解中胶层，使细胞从组织中释放出来。常用的果胶酶商品制剂：PectinaseSigmaMacerozymeR-10JapanPectolyaseY-23Japan(价格昂贵)162）纤维素酶类从绿色木霉中提取的一种复合酶制剂，其作用是降解细胞壁中的纤维素，使原生质体释放出来。常用的商品酶制剂：EA-867中科院上海植生所CellulaseOnzukaR

8、-10JapanCellulaseOnzukaRSJapan（价格昂贵）MeicelasePJapanCellulaseUSADriselase（崩溃酶，具多种活性）Japan173）半纤维素酶用于降解细胞壁中的半纤维素，主要商品制剂有：Hemic