实验六 原生质体的分离和培养.ppt

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1、实验六原生质体的分离和培养【实验目的】1.学习植物细胞原生质体分离纯化的方法。2.了解原生质体活性鉴定的原理。【实验原理】植物原生质体(protoplast)是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”,是开展基础研究的理想材料。其中,酶解法分离原生质体是一个常用的技术,其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成,因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分,除去细胞壁,即可得到原生质体。由于原生质体内部与外界环境之间仅隔一层薄薄的细胞膜,必须保持在渗透压平衡的溶液中才能保持其完整性。其次,还应当考虑取材、酶的种类和纯度、酶液的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原生

2、质体的影响。测定原生质体的活性有多种方法。荧光素双醋酸酯(FDA)染色是常用的一种方法,FAD本身无荧光,无极性,可透过完整的原生质膜。一旦进入原生质体后,由于受到酯酶分解而产生具有荧光的极性物质荧光素。它不能自由出入原生质膜,因此有活力的细胞能产生荧光,无活力的原生质体不能分解FAD无荧光产生。【实验材料和用具】材料：菊花花瓣愈伤组织或烟草幼苗叶片等。用具：过滤器，注射筒，不锈钢网筛，漏斗，烧杯，滴管，10ml刻度离心管，血球记数板等。【实验材料】材料：烟草幼苗叶片或菊花花瓣愈伤组织等。【实验仪器和用具】仪器和用具：摇床、离心机、显微镜、过滤器，注射筒，不锈钢网筛，漏斗，烧杯，滴

3、管，10ml刻度离心管，血球记数板等。【实验试剂】(1)酶解液：2%(W／V)纤维素酶,1%(W／V)果胶酶,0.6mol／L甘露醇;3.5mmol/LCaCl2.2H2O,0.7mmol/LKH2PO4,pH5.6。(2)洗涤液：0.6mol／L甘露醇;3.5mmol/LCaCl2.2H2O,0.7mmol/LKH2PO4,pH5.6(3)0.02%二乙基荧光素(FDA):5mgFDA溶于1ml丙酮中,避光4℃下贮存,使用时取0.22mlFDA贮存液加入5ml0.65mol/L甘露醇中.使用时,使最终浓度为0.01%。(4)DPD培养基【实验内容】(1)取充分展开的叶片,用自来水

4、冲洗干净。(2)在超净工作台上,叶片用0.1％升汞溶液中浸泡灭菌10min(中间摇动几次)。取出叶片,无菌蒸馏水漂洗5次。(3)将叶片放入大培养皿中,吸去水分,叶背面朝上,用无菌镊子小心撕去下表皮,或用解剖刀将叶片切成0.5mm宽的小条。(4)另取1个培养皿或带盖的三角瓶,加入酶解液10mL,放叶片约2g,浸泡。(5)在28C保温3～6h,中间轻轻摇动2—3次。(6)用200目筛网过滤酶解液,滤液经600×g离心5min,使原生质体沉淀下来。(7)用移液管吸去上清液,将沉淀的原生质体悬浮在0.2mol／LCaCl2·2H202mL中。(8)用注射器(装上长针头)向离心管底部缓缓注入

5、20％蔗糖6mL,在600×g离心5min。这时,在两相溶液的界面之间出现一层纯净的完整原生质体,杂质和碎片都沉到管底。(9)取原生质体提取液1滴于载玻片上,加入相同体积的0.02％FDA稀释液,静置5min后,于荧光显微镜下观察,发绿色荧光的为有活力的原生质体,没有产生荧光的原生质体无活力。2～3周龄愈伤组织和叶片各约1g和0.5g，叶片剪成细条加入到酶液中、用镊子分散愈伤组织黑暗、25℃酶解3~6小时，间歇轻轻摇动。愈伤组织和叶肉原生质体分离过滤和离心洗涤原生质体过滤800rpm离心3min弃上清液加入3mlCPW培养基，用滴管重新悬浮原生质体800rpm离心3min弃上清液,

6、重新悬浮在0.5mlCPW溶液中【实验报告】分别述说你观察到的三张临时装片的结果,你认为此种分离与纯化原生质体的方法如何,有无可改进或优化之处？【思考题】1.你认为要获得数量多、生活力强的原生质体,在实验中应注意那些问题?2.除了本实验介绍的方法,还可以用哪些方法判断分离的原生质体活力?