麻花艽(gentiana straminea)原生质体分离和培养研究

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1、分类号：密级：UDC：编号：20100901020542010级攻读硕士学位研究生毕业论文麻花艽（Gentianastraminea）原生质体分离和培养研究StudiesonisolationandcultureofprotoplastofGentianastramineaMaxim指导教师：何涛教授学生姓名：杨莉娜论文类型：基础研究学科专业名称：作物遗传育种研究方向：植物细胞工程学院(系、部)：农牧学院二零一三年四月QinghaiUniversityMasterDissertationStudiesonisolationandcultureofprotoplastofGentianast

2、ramineaMaximSupervisor:Prof.TaoHeCandidate:Li-NaYangAcademicMajorApplidedfor:CropGeneticsandBreedingSpecificMajor:PlantCellEngineeringCollege:CollegeofEcol-environmentalEngineeringApril,2013独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，

3、均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权青海大学大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本论文属于：保密□不保密□（请在相应方框内打“√”），在_____年解密后适用本授权书。学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月摘要摘要麻花艽（GentianastramineaMaxim

4、）又名麻花秦艽，为龙胆科植物，主要分布于青藏高原地区，是我国重点保护的野生药材之一。近年来，由于临床用药量的增加和过度采挖，致使麻花艽野生资源日趋减少。因此，开展麻花艽的细胞工程研究则显得尤为重要。为此，本研究以自然生长于青藏高原地区的麻花艽作为实验材料，在建立起体细胞胚发生再生体系的基础上，进一步对其进行原生质体游离和培养研究，为麻花艽的人工繁育、优良品种选育、遗传转化以及药用资源开发提供科学依据。主要研究结果如下：1.以无菌苗叶片为外植体，研究建立了麻花艽体细胞胚发生及植株再生体-1-1系。以MS为基本培养基，附加2.0mg·L2,4-D和0.5mg·L6-BA，适于胚性愈伤-1组织的

5、诱导；胚性愈伤组织在含有0.5mg·L2,4-D的MS培养基上继代后，在附-1加3.0mg·L6-BA的MS培养基上，最高再生频率（93.8%）和每克愈伤组织再生最高芽数（31.7）被获得；再生芽在不含激素的1/2MS培养基上就能正常生根；再生植株移栽到盆土中，大约有90%的苗存活，展示了正常的生长。2.通过HPLC测定了不同发育时期体细胞胚中的龙胆苦苷含量。随着麻花艽体细胞胚的发育，龙胆苦苷含量逐渐增加，球形体胚的龙胆苦苷含量为13.8-1-1mg·gDW，而子叶体胚则增加到22.2mg·gDW。由体细胞胚再生的苗中龙胆-1-1苦苷含量为30.7mg·gDW，高于亲本苗的23.4mg·g

6、DW。3.采用酶法分离原生质体，比较了不同外植体、渗透压、酶解时间、预处理和培养方法对原生质体游离、分裂和再生的影响，研究建立了麻花艽胚性愈伤-1组织来源原生质体的再生体系。0.5~0.6mol·L甘露醇为游离叶片原生质体的适宜渗透压调节剂浓度；5h为游离叶片原生质体的最适酶解时间。叶片经0.6-1mol·L甘露醇预处理60min后，提高了原生质体的产量和活力。从叶片中游离的原生质体产量高于胚性愈伤组织；但其活力低于后者。在3种培养方法中，固-液双层培养和液体浅层培养优于固体培养。在液体浅层培养中，叶片来源的原生质体在第6d开始第一次细胞分裂，培养14d后的分裂频率为17.6%，培养28d

7、后有2.4%的细胞形成细胞团，但没有再生愈伤组织；而胚性愈伤组织来源的原生质体在第3d开始第一次细胞分裂，培养14d后的分裂频率为31.7%，培养28d后的细胞团形成频率为7.9%，均优于叶片来源的原生质体，并最终形成了再生愈伤组织。I摘要4.从细胞学、生化和分子生物学水平上对麻花艽原生质体再生愈伤组织进行了遗传稳定性分析。再生愈伤组织的染色体数目与亲本苗相同，均为26条；在酯酶同工酶谱带上，二者基本相同，再生愈伤组织为