13第七章 原生质体的分离和培养

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1、第七章原生质体的分离和培养原生质体:是指植物细胞中除去细胞的壁的裸露部分.特点:1.有全套的遗传信息--------可完成全能性:2.同一时间获得遗传上的同质体3.实现远缘杂交;4.摄取外源DNA细胞器等-------遗传转化的理想实体.一,原生质体的分离除去胞间层(粘着)---单细胞--除去细胞壁酶解法:漆斑霉产生的纤维素酶(粗制剂)---分离番茄根尖细胞原生质体缺点:可能受到酶的影响首先:产量高,活性强,能分裂,产生愈伤组织(胚状体)最终.形成完整植株的原生质影响因素取材酶的种类酶的渗透压原生质膜的稳定剂酶解的时间、温度、纯化方法等分离:1.表面消毒

2、:苄烷铵0.1%+酒精10%--5min60%~70%酒精消毒30s---0.1%HgCl2-无菌水冲洗3~5次2.酶解:撕去叶片下表皮(向下)---漂浮于酶液中------------------真空泵处理3~5分钟(2h后)分离出原生质体3.酶纤维素酶:消化细胞壁纤维素果胶酶:降解中胶层半纤维酶酶的选择:愈伤组织、悬浮细胞-------浓度大活动强的酶叶片,,浓度小4.条件:黑暗静止轻摇时间:几~几十小时温度250C(一).原生质体供体1.取自植物体,多以叶片为主易获得酶处理简便短时间可获得大量原生质体继代培养保持胚性状态,利于获得原生质体材料

3、类型:天然:田间:野生、温室、盆栽人工材料:愈伤组织、悬浮、自制培养再生植物、试管苗(2)注意事项:a.选择具有形态分化潜力的材料;b.选择酶处理后的大量原生质材料;c.选择稳定性好,不易破碎;d.选择活性高,可持续分裂c.选择合适的基因型(关键)(2).材料的特性和生理状态a.幼嫩叶片(天然);b.4~5d无菌苗下胚轴;d.未成熟种子胚的子叶;e.禾本科植物、幼胚、幼穗、花药外植体来源的愈伤组织:优点a.幼嫩材料不受外界环境的影响;b.实验的重复性好;c.原生质体的产量、活性及稳定性好d.可原生质的分化潜力做出初步估价.(二).分离原生质体所用的酶类1.酶

4、的类型纤维素酶类果胶酶类半纤维素酶类都含有酚类、核酸酶、蛋白酶过氧化物酶杂质具一定毒性2.酶的处理凝胶柱过滤-酶液脱盐纯化3.影响因素*酶的活性与pH有关4.7~6.0*温度40~50OC最适温度原生质25~300C时间30min-------20h4.木、草本植物使用时间不同5.时间4~24h1g材料+10ml二原生质的培养1.过程:原生质---细胞再生---细胞分裂--细胞团芽和根2.培养方法细胞植板法半固体培养基琼脂糖优点:位置固定,方便观察多用液体培养基:琼脂上细胞不易分裂可降低渗透压可更换培养基可降低细胞密度(一).原生质体活性试验1.方法

5、:A.以胞质环流作为代谢活跃进行的指标;B.以氧的摄入量做指标,可通过指示呼吸代谢强度的氧电极进行测定;C.以光合活性做指标.D以完整的质膜排斥伊月蓝的能力做指标.E.以二乙酸荧光素的染色能力为指标荧光素双醋酸酯(FDA)染色法有活性:有内酯酶分解,分解-------有荧光产生无活性:无内酯酶,无荧光产生方法:(1)原生质悬浮液0.5ml,置于10mm×100mm的小管中;(2).加入贮于00C,含2mg/L的FDA的丙酮溶液成质量分数为0.01%,混匀;(3).置于室温下5min后用荧光显微镜观察有活力:荧光无活力:无荧光用荧光显微镜观察有细胞壁绿色荧光无

6、细胞壁:红色(二).培养基2.检测细胞壁是否除净荧光增白剂将纯化后收集的原生质加入0.1%--0.05%的荧光增白剂,染色5~10min.离心3min,再用0,7mol/L甘露洗去多余染料,如此重复3次.1.营养成分无机盐有机物激素条件培养基:将生长迅速的细胞在液体培养基中培养一段时间,除去细胞后收集的培养基.Ph值5.6~5.82.原生质体的培养方法(1)液体培养液体浅层培养微滴培养操作简便,伤害小分布不均匀多组合、单个　融合分布不均匀、易挥发(2).固体培养----琼脂包埋300C琼脂糖+原生质-------培养皿底部优点:提高植板效率便于观察易于统计

7、缺点:操作要求严格(3)液—固体结合培养A.液体浅层—固体平板双层培养法优点:固体培养基中的营养物质缓慢释放下层可吸收培养物产生的有害物质B.琼脂糖珠培养优点:改变了通气和营养环境促进原生质分裂以及细胞团的形成(4).饲养培养(看护培养)A.滤膜饲养法B.琼脂糖珠的饲养培养(三)植板密度1Kao-----KM8P优点:单个细胞能生壁持续分裂,形成愈伤组织2.饲养细胞层法3.两种不同物种原生质共培养此法适用于两种原生质之间能发生有效的互馈两种原生质的愈伤组织形态上可区分(四)细胞分裂和愈伤组织形成原生质体---细胞壁再生---细胞团愈伤组织-植株1.壁

8、的出现:原生质体---------球型改变---