原生质体融合技术及其应用

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1、原生质体融合技术及其应用　　摘要:原生质体融合技术作为一种重要的技术在微生物遗传育种上广泛的应用,本文从多角度全方位的对原生质体融合术应用进行详尽的解析，为该项生物技术的应用积累了宝贵的经验。　　关键词:原生质体融合应用前景遗传　　1原生质体融合技术简介　　原生质体融合就是用水解酶除去遗传物质转移的最大障碍―――细胞壁,释放出只有原生质膜包被着的球状原生质体,然后用物理或化学方法诱导遗传特性不同的两亲本原生质体融合,经染色体交换、重组而达到杂交的目的,经筛选获得集双亲优良性状于一体的稳定融合子。原生质体融合与常规

2、杂交相比有多方面的优势,除了能显著提高重组频率外,还具有定向育种的含义。此项技术能把亲缘关系比较远,甚至毫无关系的生物体细胞融合在一起,为远缘杂交架起了桥梁,是改造细胞遗传物质的有力手段,它不仅在于打破了有性杂交重组基因创造新种的界限,更重要的是扩大了遗传物质的重组范围。微生物原生质体融合技术的整个过程包括:原生质体的制备、原生质体融合、原生质体再生【1】。　　2原生质体融合技术详解　　2•1原生质体的制备与再生技术5　　微生物细胞一般是有细胞壁的,进行该项技术的第一步就是制备原生质体。当前去除细胞壁

3、的方法主要有机械法、非酶法和酶法。采用前两种方法制备的原生质体效果差,活性低,仅适用于某些特定菌株,因此，并未得到推广。在实际工作中,最有效和最常用的是酶法。该法时间短效果好。使用的酶主要为蜗牛酶或溶菌酶,具体根据所用微生物的种类而定。影响原生质体形成的因素很多,不同的微生物有其较为适当的形成条件。在菌龄选择上,多采用对数生长期或生长中后期的菌,也有的采用生长后期的,这主要是由于对数生长期细菌的壁中肽聚糖含量最低,细胞壁对酶的作用最敏感,但是对数生长早期的菌相对较为脆弱,受酶的过度作用会影响原生质体的再生率。彭智

4、华[2]等对野生大杯蕈(Clitocybemaxima)进行原生质体制备的过程中,用2种以上的酶液混合使用能提高去壁效果。陈海昌[3]等证明,在一定范围内,酶作用的时间、酶作用的浓度都与原生质体的形成率成正相关,而与再生率成反相关。林红雨等采用酶解10min后补加EDTA的方法,改变酶解环境中的离子强度和渗透压,可以提高原生质体形成率。Coster-onJ•W•等(1967)报道,在高渗Tris溶液中添加115%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等原生质体扩张剂,有助于制备原生质体,添加0̶

5、6;02mol/L镁离子,有利于原生质体的稳定。　　2•2原生质体融合的促融方法　　由于在自然条件下,原生质体发生融合的频率非常低,所以在实际育种过程中要采用一定的方法进行人为地促融合。当前常用的方法主要有:化学法、物理法和生物法等。这几种方法各有其自身的特点,在进行实际工作中可根据操作对象选择适合的融合方法。　　2•3遗传标记的选择与融合子的检出5　　假设用于原生质体融合实验两亲本的基因型分别为A和B型,那么经诱导融合,整个群体中含有五种类型:A,AA,AB,BB,B。其中只有AB型才有

6、可能形成真正的杂种细胞,而其余四种类型必须淘汰。所以考虑采用一种行之有效的筛选方法是原生质体融合实验里至关紧要的一环。下面介绍几种常用的筛选方法。　　2•3•1利用营养缺陷型作为遗传标记选择融合子　　　　即融合的双亲为营养缺陷型,并且为不同的缺陷型。双亲缺陷的原生质体融合后于基本培养基上选择融合子,缺陷的单亲原生质体由于丧失了合成某种物质的能力,在基本培养基上不能萌发生长,单亲融合的原生质体也不能长出菌落,双亲原生质体融合后,缺陷的遗传物质得到互补可以恢复为野生型,在基本培养基上能够萌发生

7、长成为菌落。　　2•3•2利用抗药性作为遗传标记选择融合子　　微生物的抗药性是其菌种的特性,是由遗传物质决定的。不同种的微生物对某一种药物的抗性存在差异,利用这种差异或与菌种其它特性结合起来即可对融合子进行选择。这种方法首先由Bradshaw和Peberdy于1984年使用。药物的浓度过高会使融合频率降低,浓度过低则会使亲本生长,影响融合子的检出。　　3原生质体融合技术在选育微生物中的应用　　3•1选育优良的菌种5　　原生质体融合广泛应用到酿酒酵母的改良。彭帮柱等以酿酒酵母16

8、05和苹果酒酵母E2为亲本,通过原生质体融合,得到融合子8#菌株,具有产香能力和发酵能力均强于双亲的优点。黎永学等以双歧杆菌和酿酒酵母为亲本进行融合,得到的融合子具有双亲的生物学特性,为双歧杆菌生物学功能的开发提供了新思路、新途径。王宪等利用原生质体融合技术获得具有双亲杀虫谱的新菌株。诸如此类的报道国内外均有。　　3•2选育抗菌素高产菌株　　在抗生素的研究中,