资源描述：
《微生物原生质体融合育种技术及其应用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、ChinaBiotechnology,2010,30(1):93297中国生物工程杂志微生物原生质体融合育种技术及其应用3丹2,3黄占斌133雨1邢建民2毛王(1中国矿业大学(北京)化学与环境工程学院北京100083)(2中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室北京1001903中国科学院研究生院北京100049)摘要工业微生物菌种选育在发酵工业中占有重要地位。微生物原生质体融合(microbialprotoplastfusion)技术具有重组频率高、受结合型或致育型限制小以及遗传物质传递完整等优点,是微生物育种最常用
2、的方法之一。结合相关研究进展,分析了原生质体融合技术的组成,包括制备、再生、融合的影响因素以及融合子的筛选方法,重点评述了原生质体融合技术应用在微生物育种中的最新进展,以及微生物原生质体融合技术的发展前景。关键词微生物原生质体融合遗传育种基因组重组中图分类号Q933微生物菌种是发酵工业中的一个关键因素,它决定了发酵过程的成败及某一发酵产品是否具有工业化价值。自然界中的原始菌株大多不具有很高的工业化价值,因此需要对菌株进行选育和改良,以提高产品的质量,降低成本。原生质体融合技术是起源于20世纪60年代的一项重要的菌种改良技术,
3、是将亲株细胞分别去除细胞壁后进行融合,经基因组间的交换重组,获得融合子的过程[1]。与其他育种技术相比,原生质体融合技术具有重组频率高、受结合型或致育型限制小以及遗传物质传递完整且不需要完全了解作用机制等优点,因而被国内外微生物育种学者广泛应用。1974年,匈牙利的Ferenczy[2]成功将白地霉(Geotrichumcandidum)营养缺陷型突变株的原生质体进行融合,使原生质体融合技术首次应用于微生物中。接下来的几十年,该技术的基本实验方法逐步完善,现已作为一项十分有用的技术广泛应用于工业微生物菌种选育中。本文就原生质
4、体融合技术的过程及其应用于微生物育种方面的最新进展做了简要综述,并分析了目前存在的问题及未来的发展方向。及其遗传标记选择,双亲本原生质体制备和再生,亲本原生质体诱导融合,融合重组体筛选,遗传特性分析和测定[3]。1.1原生质体的制备和再生原生质体的制备首先要去除细胞壁,当前去壁的方法主要有机械法、非酶法和酶法,现在使用较多的为酶法。在放线菌和细菌中,主要采用溶菌酶,酵母菌和霉菌一般用蜗牛酶、消解酶或纤维素酶等。影响原生质体制备和再生的因素很多:在菌龄上,为了使细胞易于原生质体化,一般选择对数生长期或生长中期的菌体,也有的采用
5、生长后期的菌。酶浓度以及作用时间也会影响原生质体的制备和再生率,一般来说酶浓度越高,作用时间越长,原生质体制备率就越高,但酶解时间过长又会影响再生率。对于不同的菌体,优化其最适酶浓度和作用时间非常必要。本实验室在琥珀酸放线杆菌(Actinobacillussuccinogenes)的原生质体制备和再生实验中发现采用对数生长中期的菌更易于原生质体化,在酶解琥珀酸放线杆菌(A.succinogenes)过程中,最适的酶浓度大大低于其他革兰氏阴性菌,且最佳酶解时间较短,原生质体的再生率高。另外,菌体的预处理,酶的处理温度,渗透压稳
6、定剂等都会影响微生物原生质体的制备和再生。1.2原生质体的融合由于在自然条件下,原生质体发生融合的频率非1原生质体融合技术原生质体融合技术一般分成五大步骤:直接亲本收稿日期:2009209209修回日期:20092112053国家“863”计划(2006AA100205)资助项目33通讯作者,电子信箱:zbhuang2003@163.com常低,因此在实际育种过程中要采用一定方法进行人为诱导融合。在微生物原生质体融合中,诱导融合方法主要有化学法(一般采用PEG结合高Ca2+、pH诱导法)、物理法(包括电融合和激光诱导融合法等
7、)。当用PEG法诱导原生质体融合时,很多因素影响融合频率。如PEG聚合度、PEG浓度和作用时间、离子种类和浓度、融合剂pH、温度等。一般来说相对分子质量为100026000的PEG都是有效的,PEG的浓度为30%～50%,不同相对分子质量的PEG溶液在相同质量分数时是同效的。在融合过程中,适量的Ca2+、Mg2+有助于融合,而K+、Na+则会降低融合率。PEG溶液一加入,融合就能较长时间地有效进行,但由于PEG有一质体时,向酶解液中加入不同荧光色素,使双亲原生质体在特定波长下呈现不同颜色,原生质体融合后,直接选出带有两色荧光
8、的融合子即可。龙建友等[7]将链霉素No.24菌株原生质体带上酚藏花红荧光标记,将其诱变株Ms224菌株原生质体带上伊文思蓝荧光标记,融合后,在荧光显微镜下筛选同时带有红蓝荧光的融合子。1.3.5利用某些特殊的生理特征作为标记筛选融合子利用亲本对营养物质利用及固氮能力方面的差异来筛选融合子
