食用菌生产技术 原生质体融合育种课件.ppt

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1、第四章食用菌的菌种选育第四节原生质体融合育种主讲王德芝一、原生质体融合育种技术简介原生质体是指细胞壁完全消除后余下的那部分由质膜包裹的裸露的细胞结构。原生质体融合是指通过脱壁后的不同遗传类型的原生质体，在融合剂的诱导下进行融合，最终达到部分或整套基因组的交换与重组，产生出新的品种和类型，也就是说，原生质体融合育种技术是一种不通过有性生活史而达到遗传重组或有性杂交的手段。原生质体技术是现代生物技术的一个组成部分，它包括原生质体的分离、再生、融合及外源基因转化等一系列技术。利用原生质体技术可将生物细胞或去壁的原生质在离体条件下进行培养、繁殖和精细的人工操作，使其

2、特性按照人们的意志发展，从而达到改良生物品种或创造新物种的目的。20世纪７０年代以来食用菌育种工作者开展了食用菌原生质体技术的研究，表明利用原生质体技术进行食用菌育种是一种行之有效的方法。目前，平菇、香菇、金针菇、草菇等60多种食用菌原生体的分离再生技术已相当成熟。二、食用菌原生质体的基本特点食用菌细胞外面包着一层坚硬的细胞壁。这一道天然的“屏障”阻挡着食用菌细胞间的彼此融合，并给各种遗传操作带来极大困难。游离的原生质体是真正的单细胞，在同一时间内能得到大量的遗传上同质的原生质体，为遗传学研究及用原生质体为材料开展食用菌育种提供可能性。原生质体具有以下几个特

3、点：①原生质体超越了性细胞的一些不亲合障碍，为种内、种间、属间食用菌细胞杂交提供了融合的亲本。②原生质体能有效地摄取多种外源遗传颗粒，如DNA质粒、病毒和其它细胞器，因此，在食用菌基因工程研究及基因工程育种方面具有重要作用。③游离的原生质体除去了细胞壁的阻挡，诱变剂更容易进入细胞，是良好的诱变育种的材料。此外，食用菌原生质体也和食用菌完整细胞一样具有该菌株的全部遗传信息，在合适的培养条件下，能发育成与其亲本相似的菌株。从食用菌菌丝中分离出有活性的原生质体，经再生后发育成菌落，把这种方式称为原生质体无性繁殖。食用菌原生质体无性繁殖过程也是细胞水平的筛选过程，可

4、直接从食用菌原生质体无性繁殖后代中筛选突变菌株进行品种选育。三、获得原生质体的材料能够制备原生质体的材料很多，如各种类型的有性和无性孢子、单核菌丝、双核菌丝和不同发育时期的子实体组织均能获得食用菌的原生质体。但由于材料的结构、性质不同，酶解处理后获得原生质体的数量差异很大。如担孢子具有较厚的细胞壁且成份复杂不易酶解。子实体组织不易分散不能全面接触溶壁酶，而且组织化的菌丝细胞壁也较厚不利于原生质体的释放。目前主要用幼龄菌丝体制备原生质体。从菌丝体制备原生质体主要有两个优点：①培养时间短，菌丝体生长均匀一致，进而从菌丝体中释放的原生质体，在生理和遗传特性上比较一

5、致。②该材料在液体酶液中易分散，适宜当前用酶解的方法分离原生质体。由于不同食用菌菌丝生长速度不同，获取幼龄菌丝体天数也不同。选取旺盛生长期的菌丝体：如草菇、银耳一般需要2～3天，平菇需要3～4天，香菇需要5～6天，双孢蘑菇需要7～9天，木耳则需要9～11天，菌丝体培养一般采用液体静止培养法，每瓶放十余粒玻璃珠，培养期间每天用手摇1～3次四、原生质体融合操作程序亲本菌株A亲本菌株B↓↓获得遗传标记获得遗传标记↓↓菌丝体培养菌丝体培养↓↓酶解获得纯净的原生质体酶解获得纯净的原生质体↓↓————————再生混合再生↓↓↓加聚乙二醇促融↓离心洗涤除去聚乙二醇↓融合子

6、涂布再生↓融合子检出五、原生质体融合育种方法原生质体融合需要两株亲本，亲本必须带有遗传标记，两亲本的遗传标记必须各不相同，以便筛选融合子。目前，食用菌融合常用的遗传标记有营养缺陷型标记、抗药性标记、灭活原生质体标记、自然生态标记及形态标记等。1.亲本的准备（1）营养缺陷型菌株标记：（2）抗药性菌株标记：营养缺陷型菌株和抗药性菌株的筛选在诱变育种中已介绍过。它们都是由于基因的改变而产生的表现型突变，是比较可靠的遗传标记。（3）灭活原生质体作为标记：在食用菌中采用的也比较多，可采用物理或化学因子来灭活原生质体，使原生质体失去再生能力，仅成为遗传物质的载体，与其它

7、原生质融合。其中化学试剂：是较好的灭活因子，它能专一性地抑制原生质体上某些酶的活性，从而影响原生质体的再生能力。在灭活食用菌原生质体时常用的灭活剂有，碘代乙酸胺和焦磷酸二乙酯。物理方法灭活：原生质体多采用热灭活法。（4）自然生态标记：是根据不同种、属之间，甚至种内之间的生态习性差异作为标记。生物由于生长的地理区域和生态环境不同，经长期的进化选择，都形成了独特的对生态和生活环境的适应性，这些适应性具有明显的特殊种性。如香菇中的豹皮香菇、虎皮香菇和近裸香菇，由于它们起源于热带和亚热带，对高温有较强的抵抗性，菌丝体能在32～37℃的高温范围内正常生长，而栽培香菇在

8、这个温度范围内生长很缓慢或停止生长，这些生态习性的差