原生质体培养与体细胞杂交

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1、第九章原生质体培养与体细胞杂交原生质体的获得原生质体的培养体细胞杂交原生质体的获得原生质体的概念原生质体的用途原生质体的分离原生质体的概念指植物细胞除去细胞壁以外的部分原生质体的用途植物原生质体是没有细胞壁的裸露细胞，它在一些研究方面具有独特的优势。原生质体是研究细胞骨架、细胞壁的形成与功能、细胞膜的结构、大分子物质进出细胞的过程与机理等问题的良好实验体系。遗传转化：原生质体与外源DNA共培养时，原生质体可以直接吸收外源DNA，并整合到染色体上，从而实现对植物细胞的遗传转化。通过植株再生就可以得到转基因植物。原生质体的用途体细胞

2、杂交由于原生质体没有细胞壁，所以不同的原生质体可以相互靠近，发生融合，进行细胞杂交。2个不同植物体细胞发生融合、形成新细胞的过程，称为体细胞杂交。所得到的融合细胞为杂种细胞，再通过植株再生就可能创造出新的植物个体。原生质体的分离——机械法高产量、高质量的分离原生质体是进行原生质体培养和操作的前提。方法：机械法、酶解法机械法：通过对植物组织进行切割、研磨等方法破坏植物细胞壁，使原生质体游离出来的一种方法缺点:效率极低、原生质体破碎严重，完好的原生质体数量少优点：对原生质体以后的负面影响小原生质体的分离——机械法具体方法：Klerc

3、ker（1982），大植物细胞置于高渗的蔗糖溶液中，使细胞质壁发生分离，原生质体收缩成球形，然后用利刃切割，在切割的过程中，有些细胞只被切去了细胞壁，从而释放出完整的原生质体.适用范围：某些植物的贮藏组织，如：胡萝卜的根、洋葱的鳞片等细胞高度液泡化的组织.原生质体的分离——酶解法酶解法：1960年由英国的Cooking发明，是利用一些酶分解植物细胞壁而获得原生质体的一种方法。植物细胞壁组成：纤维素、半纤维素和果胶质优点：分离原生质体的效率很高，用少量的材料就可以得到大量完整的原生质体，已成为分离原生质体的最主要方法酶制剂：纤维素

4、酶、半纤维素酶、果胶酶（离析酶）、崩溃酶（纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶）具体步骤：材料的选择材料来源：细胞分裂旺盛的外植体，如幼嫩小苗的根、胚轴、子叶、幼叶等；处于快速生长期的愈伤组织或悬浮细胞.对于容易培养、再生那里较强的双子叶植物（如烟草、菊花、胡萝卜、矮牵牛等）也可用完全展开的叶片作材料.用于分离原生质体的植物材料要培养在最佳的光温条件下.原生质体的分离——酶解法酶解处理酶解处理对以后的原生质体培养至关重要.原则：利用尽可能低的酶浓度和尽可能短的酶解时间来获得大量有活力的原生质体.酶解液的准备：由于植物细胞壁的主要成分是纤

5、维素、半纤维素和果胶质组成的，所以，酶解液中一般含有纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶，浓度为0.5-2.0%原生质体的分离——酶解法渗透压的调节必要性：为了保持释放出来的原生质体的活力和膜稳定性，必须使原生质体处于一个等渗环境中。因此，酶解液中必须加入渗透压调节剂。常用的渗透压调节剂有：葡萄糖、甘露醇和山梨醇等，浓度一般为0.35-0.8mol/L。具体用什么浓度，要根据材料的水势来确定。原生质体的分离——酶解法加入其它物质酶解液中加入较高浓度的Ca2+可以提高膜的稳定性；加入葡聚糖硫酸钾、KH2PO4也可以提高原生质体的稳定性和活

6、力；加入牛血清蛋白可防止酶解过程对细胞膜和细胞器的破坏；在酶解液中加入pH缓冲剂有利于保持酶解液的酸碱环境的稳定，增加原生质体的释放量和原生质体的稳定性。原生质体的分离——酶解法原生质体的分离——酶解法注意事项酶解液配制好后，要用过滤灭菌的方法进行灭菌，并且随配随用.原生质体的分离——酶解法酶解就是将无菌材料放入酶解液中、释放出原生质体的过程。有菌材料，则必须进行表面消毒处理。叶片、幼茎和根等材料要切成小片，叶片最好撕去下表皮。悬浮细胞则要离心后再酶解。原生质体的分离——酶解法用量：材料与酶解液的比率为2-10g/100ml酶解

7、液。温度和光照：一般在25±2℃、黑暗中酶解，期间轻轻摇动几次，或放在50rpm的摇床上。时间：酶解时间因材料而异，2小时-10几小时。叶片的酶解法分离原生质体原生质体的收集与纯化过滤：酶解结束后，要及时的将酶解物通过孔径为20-80µm的不锈钢筛网过滤，除去未被酶解的组织块和细胞团。离心：滤液转到离心管中在50×g下离心5min。反复洗涤：离心结束后，弃去上清液，用培养基和原生质体洗液重新悬浮沉淀的原生质体，再离心。如此反复2-4次，就可以将残留的酶液去掉。纯化：如原生质体不纯（如含有较多的细胞碎片），可用含高浓度（21%）蔗

8、糖的培养基进行离心、纯化，完整的原生质体漂浮在上清液的上部。原生质体的分离——酶解法完整的原生质体原生质体的分离——酶解法原生质体活力的测定原生质体活力的高低对后来的原生质体培养和融合影响极大。测定原生质体活力的方法常用荧光素双醋酸酯（FDA）染色法。原生质体活