A细胞工程第2节—原生质体培养和体细胞杂交

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1、第六章　植物原生质体培养和体细胞杂交陈观水生命科学学院jimchen7909@163.com13905914445第六章植物原生质体培养和体细胞杂交主要内容：第一节原生质体的分离和纯化第二节原生质体培养第三节植物体细胞杂交学习的目标与要求：掌握植物细胞原生质体培养的意义，了解原生质分离方法，原生质纯化方法和活力测定方法。掌握原生质体融合概念、介绍原生质体融合方法，了解杂种细胞的筛选、鉴定和杂种植株的鉴定方法。植物原生质体培养和体细胞杂交原生质体的概念植物原生质体(protoplast):指将植物细胞壁去掉后得到的

2、裸露的球形细胞原生质体的特性去壁的原生质体容易实现外源遗传物质的导入和吸收。原生质体具有细胞全能性。不同来源的原生质体具有彼此融合的能力。原生质体培养将植物细胞游离成原生质体，在适宜的培养条件下，使其再生细胞壁，进行经过培养成完成植株植物原生质体培养和体细胞杂交原生质体植物原生质体培养和体细胞杂交原生质体的生物学意义细胞原生质体酶解体细胞融合遗传转化共培养显微操作基因枪导入原生质体培养细胞培养愈伤组织诱导再生植株植物原生质体培养和体细胞杂交体细胞杂交(somatichybridization)又称为原生质体融合(

3、protoplastfusion),是指在人工控制条件下，不经过有性过程，两种体细胞原生质体相互融合产生杂种细胞，并使之分化再生,形成新物种或新品种的技术。植物原生质体培养和体细胞杂交植物细胞的融合过程植物原生质体培养和体细胞杂交1978年德国科学家梅歇尔斯等人把马铃薯(potato)和番茄(tomato)的原生质体融合获得了体细胞杂种“泡马豆”（pomato)一、原生质体的分离和纯化1.原生质体的分离1)材料来源植物幼嫩的叶片无菌实生苗的子叶和下胚轴外植体来源的愈伤组织和悬浮细胞系花粉细胞2)材料的预处理用黑暗

4、处理、低温处理和不同光质照射等方法，可提高某些材料原生质体的产量和活力。一、原生质体的分离和纯化1.原生质体的分离3)酶的种类及酶液配制原生质体分离常用的商品酶一、原生质体的分离和纯化1.原生质体的分离4)分离方法一、原生质体的分离和纯化1.原生质体的分离4)分离方法一、原生质体的分离和纯化1.原生质体的分离4)分离方法机械分离法：先将细胞放在高渗糖溶液中预处理，待细胞发生轻微质壁分离，原生质体收缩成球形后，再用机械法磨碎组织，从伤口处可释放出完整的原生质体。缺点：获得完整的原生质体的数量比较少，能够用此法产生原

5、生质体的植物种类受到限制。优点：该方法可避免酶制剂对原生质体的破坏作用。一、原生质体的分离和纯化1.原生质体的分离4)分离方法酶解分离法：指将材料放入能降解细胞壁的混合等渗酶液中保温一定时间，在酶液的作用下，细胞壁被降解，从而获得大量有活力的原生质体的方法。常用的酶种类：纤维素酶类（纤维素酶、半纤维素酶、崩溃酶[Driselase]）、果胶酶类（果胶酶和离析酶[Macerozyme]）、蜗牛酶和胼胝质酶。一、原生质体的分离和纯化1.原生质体的分离4)分离方法酶解分离法优点：获得量大，适用广泛。缺点：商品酶制剂均含

6、有核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶以及酚类物质会影响所获原生质体的活力一、原生质体的分离和纯化1.原生质体的分离4)分离方法酶解分离法一、原生质体的分离和纯化1.原生质体的分离4)分离方法Principlestepsinenzymaticisolation一、原生质体的分离和纯化2.原生质体的纯化1)过滤-离心法2)漂浮法3)界面法一、原生质体的分离和纯化2.原生质体的纯化1)过滤-离心法利用比重原理，在具有一定渗透压的溶液中，先进行过滤然后低速离心，使纯净完整的原生质体沉积于试管底部。优缺点：纯化原生质体比较简单。由

7、于原生质体沉积于试管底部，造成相互挤压，常引起原生质体的破碎。一、原生质体的分离和纯化2.原生质体的纯化2)漂浮法采用比原生质体密度大的高渗溶液（蔗糖、Percoll、Ficoll），使原生质体漂浮在液体表层的纯化方法。优点：(1)可以避免分离的原生质体因震荡被组织碎片撞击而破损。(2)所用药品简单，成本低。缺点及补救措施：对离心力要求比较严格，掌握不好，原生质体则不易漂浮。可采用不同浓度和不同离心速度分次漂浮的方法。飘浮法Protoplast一、原生质体的分离和纯化2.原生质体的纯化3)界面法又称不连续梯度法，

8、采用两种密度不同的溶液形成不连续梯度，通过离心使原生质体与破损细胞分别处于不同液相中，从而纯化原生质体的方法。优点：可以收集到数量较大的纯净原生质体，同时避免收集过程中原生质体因相互挤压而破碎。一、原生质体的分离和纯化2.原生质体的纯化加培养基使原生质体密度为104－106/mL原生质体混合液收集滤液去上清洗液重悬原生质体培养基重悬原生质体去上清40-100μm过滤500