第九章 植物原生质体培养与体细胞杂交ppt课件.ppt

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1、第六章植物原生质体培养与体细胞杂交第一节植物原生质体培养与植株再生第二节植物体细胞杂交取纯化后的植物原生质体悬浮液0.5ml置于小试管中，加入含2mg/L的FDA的丙酮溶液，使最终浓度为0.01％，混匀，放置5分钟，荧光显微镜观察（激发光滤光片QB-24，压制滤光片JB-8），有活力原生质体发绿色荧光，不产生荧光为无活力。对于叶肉、子叶、下胚轴而言，由于叶绿素的关系，原生质体发黄绿色荧光的为有活力的，发红色荧光的为无活力的。此外，还可用细胞壁染色法来鉴定活力.研究表明，葡萄糖是原生质体培养最理想的渗透压稳定剂和碳源，有利于原生质体的生长、细胞壁的再生

2、、再生细胞的分裂和细胞团的增殖，并维持细胞的持续分裂直至形成细胞团，使用浓度为0.4-0.5mol/L。但随着细胞壁的再生和细胞的持续分裂，渗透剂的浓度需不断降低才有利于培养物的生长。一般通过添加新鲜培养基的方法，每1-2周使渗透剂的浓度降低0.05-0.1mol/L。用于原生质体培养的培养基中，大量盐浓度应比细胞培养的培养基低。大量元素中钙离子和铵离子对原生质体培养影响最大，较高的钙离子可提高原生质体的稳定性。因此，在很多植物培养中用1/2MS培养基（钙离子保持MS培养基中原有浓度）。植板率:每个平板接种细胞总数中形成细胞团的百分率。1

3、.4.3原生质体培养方法1、液体浅层培养原生质体（约2×105/ml密度）悬浮在液体培养基—将悬浮物质移到直径为60cm的平皿中（2-3mm为宜）—5-10天后开始原生质体分裂特点：通气好，原生质体代谢物易扩散，防止有害物质积累过多造成毒害，转移添加新鲜培养基方便，便于观察和照相。操作简单，可微量培养，细胞植板率高。但原生质体沉淀，分布不均，细胞团聚集多，难成单细胞株系。2、平板法培养原生质体（密度为4×105/ml）与等量体积琼脂糖培养基均匀混合—置于6cm培养皿（2-3mm）,暗培养—5-7天原生质体开始分裂特点：原生质体分布均匀，利于分裂，

4、容易获得单胞株系，可定位观察。原生质体易受热伤害，易破碎，原生质体始终处于高渗透压胁迫下生长发育缓慢，植板率低。3、悬滴法培养将含一定密度原生质体的悬浮液，滴在6cm培养皿盖内侧上，皿底加入培养液和渗透剂等液体保湿，此时培养小滴悬挂在皿盖内。特点：用材少，培养液消耗少，利于通风与观察，可做原生质体不同密度的培养对比试验，进行单细胞培养。4、双层培养法固体培养和液体培养浅层培养相结合的方法，效果最佳。原生质体采用平板培养方法包埋在培养皿底层，上面再加入相同成分的液体培养基，暗培养。需更换新鲜液体培养基。特点：原生质体分布均匀，有利于分裂，易获单

5、细胞株系，能除去抑制分裂的有害物质，细胞植板率高。原生质体易受热伤害，易破碎。5、饲喂培养法将饲喂的细胞用培养基作平板，此平板称饲喂层，用X射线或紫外线照射，使核失活但细胞存活，然后将原生质体以液体浅层培养或平板技术铺在饲喂层上。特点：以一种植物细胞制成的平板，支持另一种植物原生质体的生长。饲喂层没有种的特异性。1.4.4原生质体培养条件25-27℃，光照16h/d，最初几天经常摇动，以助透气。1.4.5原生质体存活率、密度及产量的测定1.双醋酸盐荧光素染色法测定存活率存活率=存活原生质体数/总原生质体数×100%2.测定原生质体的密度原生质体的

6、密度（个/ml）=（原生质体数/1区域）×104×稀释倍数3.原生质体产量的测定Y=DV/FWY（个/g）——原生质体产量D（个/ml）——存活原生质体密度V（ml）——制备所得原生质体悬液的总体积FW（g）——制备原生质体所用材料的鲜重如果原生质体开始阶段在液体或软琼脂或琼脂糖培养基中培养，则此时应转到用琼脂或琼脂糖固化的培养基上。非洲紫罗兰Cellwallswereformedandthecellsbegantodivideafter8to10daysofgrowthinthedarkinAfricanviolet.Afterabout4w

7、eeksofculture,smallclumpsofunorganizedcells,orcalli,couldberemovedandplatedonamediumsolidifiedwithagaroseinAfricanviolet.Theyoungplantswerevisibleunderastereomicroscope,theculturesweremovedtothelightandplacedonashootelongationmediuminAfricanviolet.Morethan2,000plantshavebeentra

8、nsferredtothegreenhouse.Thesearegrowingvigorously,anda