新生大鼠HIBD晚期神经细胞凋亡及bFGF对其影响

《新生大鼠HIBD晚期神经细胞凋亡及bFGF对其影响》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、中国医科大学博士学位论文新生大鼠HIBD晚期神经细胞凋亡及bFGF对其影响姓名：王菊莉申请学位级别：博士专业：儿科学指导教师：韩玉昆2002.12.1新生大鼠HIBD晚期神经细胞凋亡及。bFGF对其影响中文摘要目的新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)可致新生儿死亡或永久性的神经系统损伤，现已证明，新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)后存在神经细胞凋亡，主要位于实验侧皮层、海马、丘脑及纹状体。Caspase家族，是近年来新发现的一类天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶，哺乳类启今已发现至少14种Caspases参与细胞凋亡。Capase一3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，一

2、旦被激活，凋亡常难以避免，因此Caspase一3是有可能被阻抑的最下游凋亡执行蛋白，该酶是否被激活也是鉴别细胞凋亡与坏死的主要依据。Caspase一3与ted一3高度同源，是细胞在执行PCD过程中的关键步骤。已证明，大脑缺血后表达、裂解并活化了Caspase一3。大量研究已证明，新生大鼠HIBD后Caspase一3活化参与了神经细胞凋亡。m后连续表达活化的Caspase一3和凋亡性形态的细胞持续存在达数天提示在新生儿缺氧缺血性脑损伤中凋亡持续存在。Bel—xL是Bcl一2家族成员之一，具有抗凋亡作用，Bel—xL表达增加可阻止Caspase一3活化，从而阻止凋亡的级

3、联反应。本文研究新生大鼠缺氧缺血性脑损伤神经细胞凋亡持续时程，新生大鼠HIBD晚期Caspase一3、Bcl一】【L基因及其蛋白表达情况，以及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对HIBD晚期神经细胞凋亡的影响。方法选用本院动物室提供的健康新生7日龄Wistar大鼠为研究对象，用Rice法制成HIBD模型。缺氧浓度为84-l％，舱温36±1。C，缺氧持续1．5·l·小时。本实验采用此模型进行以下实验。在缺氧缺血(HI)后不同时间处死取脑进行研究，并设同批正常组及假手术组作对照，研究内容如下：1．应用苏木素一伊红(HE)染色、透射电镜、流式细胞检测术(FCM)及末端脱氧

4、核苷酸转移酶(TdT)介导的生物紊化一dUTP原位缺口末端标记(TUNEL)研究新生大鼠HIBD晚期神经细胞凋亡持续时程。2．应用逆转录聚合酶链式反应(RT—PCR)及免疫组织化学方法研究与凋亡有关的基因Caspase一3、Bcl一)【L的mRNA及其蛋白在新生大鼠HI后晚期在脑中表达的情况。liT—PCR：反转录合成cDNA第一链(RT)。然后进行PCR扩增，用GIS一700D凝胶扫描成像分析系统扫描各扩增产物，Casapse一3mRNA及Bel—yJ_anRNA表达水平以GAPDH的相对表达量即Caspase一3／GAPDH及Bcl—xL／GAPDH计算，数据进

5、行t检验。免疫组织化学方法：标本为脑组织石蜡切片，预先经电炉加热抗原修复，进行SABC染色。结果判定：400倍光镜下观察每组每个时间点各5只大鼠脑组织切片(各二张)，经数码相机采样，左右皮层及海马各5个视野，输入MetaMorphImagerSystemVersiorA．6，将大脑皮层的免疫阳性细胞的染色强度变成量化指标，计算其平均光密度(OD)值，两组间比较采用t检验。3．观察碱性成纤维细胞生长因子对新生大鼠HIBD持续保护机制以及在新生大鼠HIBD晚期不同bFGF治疗方案对Caspase一3和Bcl—xL蛋白表达、DNA断裂的影响。首先制备新生大鼠HIBD模型，

6、随机分成6组：bFGFl组(HI后腹腔注射bFGF4u·g～，连用3周)、bFGF2组(HI后腹腔注射bFGF4u·g～，第一及第三周用)、bFGF3组(HI后腹腔注射bFGF4u·g～，仅第一周用)及相应治疗方案的生理盐水对照组即对照1组、对照2组、对照3组，各组大鼠均于王II后3周处死，每组各5只。比较TUNEL染色阳性细胞数及免疫组化方法观察Caspase一3、Bcl—xL蛋白表达情况。结果1．HE染色：HIBD动物模型组，在m后2周、3周、4周时左侧大脑后扣带皮层区神经细胞明显少于右侧，额顶皮层运动区及额顶皮层躯体感觉区均可见神经细胞明显减少，皮层以Ⅲ一Ⅳ层

7、细胞减少较I一Ⅱ层明显，代之以较多的星形胶质细胞；在HI后3周时即可见脑组织形成界限清楚的坏·2·死灶，坏死灶中可见较多的少突胶质细胞及小胶质细胞，半暗带内可见细胞呈三种变性形态：①细胞皱缩、核浓缩；②胞浆内核碎片；③单个圆形凋亡小体。有者在左侧丘脑处亦可见坏死灶。右侧扣带区皮质常为散在神经元丢失、神经元排列紊乱等改变，正常组及假手术组均未见到明显的病变。2．TUNEL染色结果：发现HI后2周、3周和4周时在额顶皮层躯体感觉区、纹状体、丘脑及海马处有一些散在的染色质浓缩呈黄色颗粒的圆形或卵圆形的凋亡细胞，以额顶皮层躯体感觉区相对多见，在半暗带内亦可见凋亡细胞，皮