氨对肝硬化大鼠模型脑神经细胞凋亡的影响

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1、中国医科大学硕士学位论文氨对肝硬化大鼠模型脑神经细胞凋亡的影响姓名：刘洪艳申请学位级别：硕士专业：传染病学指导教师：王静艳20030301率文摘要疆的、氨是弓l起J

2、盱性脑病(HE)的～种主要的异常代谢产物，高血氨是尽翦公认的肝性脑病发病的一个重要的因素，有学者报告一些肝性脑病病人的黢CT可见髓显的大脑皮质萎缩，病理学检查可见大脑或小脑季孛经元消失，但其发生的病理学基础尚不清楚，目前汪鸯实验证睨氮可以弓l起体外培养胚胎大鼠脑皮质神经细胞凋亡。本獗究拟应用肝硬他动物模型，绘予氨负荷来研究氨对脑神经缨胞凋亡的影响。厂f材料与方法＼实验动物必健康雄性Wistar大鼠，根据4种不同

3、处理方法将太鼠随机分成4组：正常对照组：不加外界干预因素；正常氨负荷对照组：实验寒绘子氨负旖；实验对照组：应用四氯化碳制备肝硬化模型，不加钋界干预因素；实验组：制备肝硬化模型，实验末给予氮受蘩。备组大鼠在给予氨负荷裁及20分钟后分别经内眦静脉应用抗凝管采斑并在半小对灰应用vitrosAMON千片比色法测定囊氨值。绘药屠2小时内观察大鼠的状态，应用角膜反射及翻转反射起莓在与否判断是否伴有翳性脑瘸的发生。2小B寸后处死大鼠，处死翦经心脏采囊检测谷嚣转氮酶(A腿)、谷草转氨酶(AST)萃瑟总疆红素(TBil)。处死屠立即取大艟及肝右时组织，应用4％多聚甲醛露定。常规染龟显微镜观察

4、肝膝组织的改变，以确定肝硬诧模型是否形成；镜下观察脑组织的形态改变，芽应用末端脱氧核替酸转移酶介导的寒端标记(TUNEL)法对石蜡包埋的脑组织进行籍缨脆穗亡的检测。DAB恳色后，缨驻核星深棕黄色染色的为箍亡细胞，予显微镜下计数凋亡指数(A1)。·1，结果1．实验组中有3只大鼠角膜反射与翻转反射消失，证明出现肝性脑病；正常对照组、正常氨负荷对照组及实验对照组角膜反射与翻转反射存在，均未出现肝性脑病。实验对照组有5只生成腹水，实验组有6只生成腹水。显微镜下观察：实验组及实验对照组肝小叶结构破坏，纤维组织增生，有明显硬化结节形成；正常对照组及正常氨负荷对照组肝脏结构正常；实验组与

5、各对照组脑组织均未见异常。2．分别比较实验对照组及实验组与正常对照组的ALT、AST、TBil及0分血氨水平，具有显著性差异，说明动物模型组存在肝功能改变，血氨水平也高于正常。实验组给予氨负荷后血氨值与正常氨负荷组、实验对照组比较有明显增高，经检验具有非常显著性差异(P<0．01)。实验对照组脑细胞AI与正常对照组比较具有显著性差异(P<0．05)；实验组脑细胞AI与实验对照组及正常氨负荷对照组比较具有非常显著性差异(P<0．01)，其中发生HE的大鼠脑细胞AI都大于均数。讨论肝性脑病是肝硬化晚期常见的严重并发症，它的发病机理目前尚未完全清楚，其中氨中毒理论是目前公认的发病

6、机制之一。肝硬化病人肝功能逐渐恶化，肝内外侧支循环的建立使来自肠道的氨绕过肝脏直接进入体循环，氨的生成增多而清除减少，使体内氨水平逐渐升高，当氨进入脑组织时，可以干扰脑的能量代谢，影响Na+一K+一ATP酶的活性，破坏血脑屏障的完整性，干扰神经递质问的平衡。目前研究证实凋亡蛋白酶激活因子一1(Apaf一1)是一种诱导凋亡的因子，它有一个结合ATP的位点，氨由于能够干扰脑的能量代谢，这可能是氨引起肝性脑病的一个作用机制。·2·本研究应用大鼠肝硬化动物模型给予氨负荷后发现：肝硬化大鼠血氨水平已高于正常，而且对氨负荷耐受性下降，给予氨负荷后，血氨水平则更显著升高，再一次证实了氨在

7、HE中的作用。神经细胞的死亡有二种方式：坏死和凋亡，后者是一种更轻微的、非炎症的、依赖能量的细胞死亡方式。细胞凋亡是一种生理调节机制，参与调节机体发育、细胞分化及体内正常的细胞更新，受细胞内外因素的影响。近年来对细胞凋亡的分子机理研究显示，细胞凋亡是一个遗传的程序性过程，是基因表达的结果，当细胞凋亡相关基因的组成成分发生突变或出现数量异常时，此过程可受到干扰，从而引起细胞增殖与死亡的平衡障碍，进而导致多种疾病的发生。许多研究证实一些神经退行性疾病与神经细胞凋亡有关：如早老性痴呆，帕金森氏症，脊柱肌肉萎缩，肌萎缩性侧索硬化。本研究通过TUNEL检测发现脑细胞在正常情况下未加任

8、何处理因素时，也可发生少量的细胞凋亡；实验对照组AI值与正常对照组之间比较具有显著性差异，前者的血氨高于后者(P<0．01)，说明氨能够引起肝硬化大鼠模型脑细胞凋亡；在给予氨负荷后，实验组与实验对照组相比，脑细胞凋亡指数有所增加，实验组与正常给予氨负荷组比较，脑细胞凋亡指数也明显增加，实验组与以上比较的两组血氨水平存在明显差异，说明血氨越高，细胞凋亡越明显。本实验不仅进一步证实氨是能够诱发HE的一个因素，而且发现氨可以促进肝硬化大鼠脑细胞凋亡。实验组给予氨负荷后发生肝性脑病的大鼠脑细胞凋亡指数都大于均数，说明肝性脑