试析糖多孢红霉菌酮还原酶基因的克隆及其在手性醇中的应用

《试析糖多孢红霉菌酮还原酶基因的克隆及其在手性醇中的应用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、武汉科技大学硕士学位论文糖多孢红霉菌酮还原酶基因的克隆及其在手性醇中的应用姓名：张敏申请学位级别：硕士专业：化学工艺指导教师：吕早生20081118武汉科技大学硕士学位论文第1页摘要具有特定功能基团的手性醇是合成手性药物的重要中间体，从羰基化合物不对称还原合成手性醇，已成为手性合成的一个重要部分。在羰基的不对称催化还原反应研究中，生物催化以其温和的反应条件、对环境的压力较小和较高的光学选择性，在羰基不对称还原合成中占有很重要的地位。选择合适的生物催化剂对于生物催化至关重要。2006年Bali等报道了短链脱氢酶家族(short．c

2、haind曲ydingenues蛳i15SDR)成员之一的糖多孢红霉菌聚酮合成酶中的酮还原酶对很多的底物，都有比较好的生物选择性还原能力，特别是对结构中含有环己酮的底物。本实验以糖多孢红霉菌基因组作为DNA供体，并根据2005年Alexalldros的报道设计特异性引物，扩增野生型的糖多孢红霉菌聚酮合成酶中的酮还原酶域基因(eryKRl)。再根据Genballl(中报道的eryI@1基因和放线菌素聚酮合成酶中的酮还原酶基因(ActKR)，设计了用于定点突变的特异性引物，利用重叠PCR技术将KRl中决定其底物特异性的位点定点突变为

3、ActKR中决定其底物专一性的那段基因位点，得到突变的KRl片段命为够yKRlM。将其克隆到表达载体pET-28a上，从中挑选阳性克隆菌株pET．eryKRl和pET-e叫KRlM进行测序。用同样的方法构建重组质粒pET-GDH作为辅酶再生。将重组质粒pET．GDH，pE％啦l和pE％郴lM转化到大肠杆菌BL21中进行表达。加定量的IPTG诱导6小时后，通过SDS．PAGE检测重组蛋白的表达。最后通过发酵检验野生型和突变后的酮还原酶对四种底物(4．氯乙酰乙酸乙酯，苯乙酮，2．辛酮和环己酮)还原作用。结果表明，扩增eryl氓1，e

4、ryl@1M基因的最佳退火温度为68℃，GDH基因的最佳退火温度为54℃。扩增的eryKRI，eryKRlM和GDH基因所对应的蛋白序列与报道的同源性高达98％。pET_eryKRlM中的目标基因与Genballl(中报道的KRl基因仅在控制底物专一性的位点处不同，被放线菌素聚酮合成酶中的酮还原酶基因(ActI①)上的这段位点所取代，这也与我们设想一致。另外，SDS．PAGE检测出eryKRl，eryKRlM，GDH目标蛋白带。最后，发酵实验结果表明野生型的eryKRl对坏己酮有很好的还原作用，而eryKRlM对环己酮的作用降低

5、。这为今后该工程菌应用于手性醇的生物催化奠定了一定的基础。关键词：手性醇；不对称还原；酮还原酶域；重叠PCR第1I页武汉科技大学硕士学位论文AbstractChiralalcoholswithspecialfunctionalgroupsareimportantbuildingblocksforsynthesizingchiraldrug，andsynthesizingehiralalcoholsbytheasymmetricreductionofcarbonylcompoundshasbecomeanimportantpart

6、ofchiralsynthesis．Biocatalysisplaysaveryimportantroleincarbonylasymmetricreductionbecauseofitsmildreactionconditions，lessstressfulenvironmentandefficientstereoselectivity．Screeningthemostsuitablebiocatalystis’critical．In2006，Balireportedthatketoreductaseofpolyketides

7、synthaseinSaccharopolysporaerythraeaasoneofthemembersofshort—chaindehydrogenasesuperfamilyexistedoptimisticabilityofbiologicalselectivereduction，especiallytothesubstrateswhosestructurescontaincyclohexanone．Inthiswork，DNAofS．erythraeawasextracted．Theprimersequenceswer

8、edesignedaccordingtotheresultAlexandrosreported．WeclonedthemilderyKR1gene．Basedonthenucleotidesequencesoftheketoreductasefromthefir