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时间:2020-08-15
《醛糖还原酶基因AR的克隆.doc》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在应用文档-天天文库。
1、醛糖还原酶基因AR的克隆一、醛糖还原酶DNA模板的构建抽取人体血液,经过亲和色谱法提取mRNA,该过程可用商业化的试剂盒分离系统,得到高纯度mRNA。再用RT-PCR法,逆转录出c-DNA,再合成AR基因。二、引物设计登陆NCBI网站,进入“核酸”中,输入醛糖还原酶的登陆码:U37100,找到该序列:1CAAAAACAGCAACAGAAAGCAGGACGTGAGACTTCTACCTGCTCACTCAGAATCATTTCT61GCACCAACCATGGCCACGTTTGTGGAGCTCAGTACCAAAGCCAAGA
2、TGCCCATTGTGGGC121CTGGGCACTTGGAAGTCTCCTCTCGGCAAAGTGAAAGAAGCAGTGAAGGTGGCCATTGAT181GCAGGATATCGGCACATTGACTGTGCCTATGTCTATCAGAATGAACATGAAGTGGGGGAA241GCCATCCAAGAGAAGATCCAAGAGAAGGCTGTGAAGCGGGAGGACCTGTTCATCGTCAGC301AAGTTGTGGCCCACTTTCTTTGAGAGACCCCTTGTGAGGAAAGCCTTTGAGAAG
3、ACCCTC361AAGGACCTGAAGCTGAGCTATCTGGACGTCTATCTTATTCACTGGCCACAGGGATTCAAG421TCTGGGGATGACCTTTTCCCCAAAGATGATAAAGGTAATGCCATCGGTGGAAAAGCAACG481TTCTTGGATGCCTGGGAGGCCATGGAGGAGCTGGTGGATGAGGGGCTGGTGAAAGCCCTT541GGGGTCTCCAATTTCAGCCACTTCCAGATCGAGAAGCTCTTGAACAAACCTGGACTGAAA60
4、1TATAAACCAGTGACTAACCAGGTTGAGTGTCACCCATACCTCACGCAGGAGAAACTGATC661CAGTACTGCCACTCCAAGGGCATCACCGTTACGGCCTACAGCCCCCTGGGCTCTCCGGAT721AGACCTTGGGCCAAGCCAGAAGACCCTTCCCTGCTGGAGGATCCCAAGATTAAGGAGATT781GCTGCAAAGCACAAAAAAACCGCAGCCCAGGTTCTGATCCGTTTCCATATCCAGAGGAAT841GTGATTG
5、TCATCCCCAAGTCTGTGACACCAGCACGCATTGTTGAGAACATTCAGGTCTTT901GACTTTAAATTGAGTGATGAGGAGATGGCAACCATACTCAGCTTCAACAGAAACTGGAGG961GCCTGTAACGTGTTGCAATCCTCTCATTTGGAAGACTATCCCTTCGATGCAGAATATTGA1021GGTTGAATCTCCTGGTGAGATTATACAGGAGATTCTCTTTCTTCGCTGAAGTGTGACTAC1081CTCCACTCATGTC
6、CCATTTTAGCCAAGCTTATTTAAGATCACAGTGAACTTAGTCCTGTT1141ATAGACGAGAATCGAGGTGCTGTTTTAGACATTTATTTCTGTATGTTCAACTAGGATCAG1201AATATCACAGAAAAGCATGGCTTGAATAAGGAAATGACAATTTTTTCCACTTATCTGATC1261AGAACAAATGTTTATTAAGCATCAGAAACTCTGCCAACACTGAGGATGTAAAGATCAATA1321AAAAAAATAATAATCAT
7、该段序列在70---1020bp可以合成蛋白质1、将上述数据导入到软件中(PrimerPremier)2、根据起始密码子(AUG)和终止密码子(UAG、UGA、UAA),点击“Find”分别找出各位置:ATG:70、106、502、925TAG:1115TGA:1018TAA:1114选择起始密码为502,终止密码为1018.输入软件300bp到900bp选择如下片段5`TCGGCAAAGTGAAAGAAG3`3`CTGATAGGGAAGCTACGT5`根据所选序列(143—1011)选择酶切位点在143—1011
8、序列含有的酶切位点有在目的序列外的限制性内切酶有选择EcoRⅠ和XbaⅠ作为双酶切限制性内切酶,EcoRIG^AATTCXbaIT^CTAGA则上游引物序列:5`ATATG^AATTCGAT---TCGGCAAAGTGAAAGAAG3`下游引物序列:5`TGCT^CTAGAT---TGCATCGAAGGGATAGTC3`三、PCR扩增1、为了减少非靶序列的扩
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