醛酮还原酶的基因挖掘及反应工程研究

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1、分类号：Q55单位代码：10183研究生学号：2015344024密级：公开吉林大学硕士学位论文（专业学位）醛酮还原酶的基因挖掘及反应工程研究Thestudyofgeneminingforaldo-ketoreductasesandreactionengineering作者姓名：谢盼盼类别：工程硕士领域（方向）：分子酶学及手性分子合成指导教师：郑良玉教授培养单位：吉林大学生命科学学院2018年5月醛酮还原酶的基因挖掘及反应工程研究Thestudyofgeneminingforaldo-ketoreductasesandreactionengineering作者姓名：谢盼盼领域（方向）：分

2、子酶学及手性分子合成指导教师：郑良玉教授类别：工程硕士答辩日期：2018年5月29日未经本论文作者的书面授权，依法收存和保管本论文书面版本、电子版本的任何单位和个人，均不得对本论文的全部或部分内容进行任何形式的复制、修改、发行、出租、改编等有碍作者著作权的商业性使用（但纯学术性使用不在此限）。否则，应承担侵权的法律责任。吉林大学硕士学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交学位论文，是本人在指导教师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完

3、全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》投稿声明研究生院：本人同意《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》出版章程的内容，愿意将本人的学位论文委托研究生院向中国学术期刊（光盘版）电子杂志社的《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》投稿，希望《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》给予出版，并同意在《中国博硕士学位论文评价数据库》和CNKI系列数据库中使用，同意按章程规定享受相关权益。论文级别：■硕士□博士学科专业：生物工程论文题目：醛酮还原酶的基因挖掘及反应工程研究作者签名：指导教师签名：年月日作者联系地址（邮编）：作者联系电话：摘要醛酮

4、还原酶的基因挖掘及反应工程研究卡巴拉汀(Rivastigmine，(S)-3-[1-(dimethylamino)ethyl]phenylethyl(methyl)carbamate)是一种可有效治疗阿尔茨海默症(Alzheimer’sdisease)的药物。N-乙基甲基氨基甲酸-3-[(1S)-羟乙基]-苯基酯((S)-NEMCA-HEPE)是制备卡巴拉汀的关键中间体。本论文利用醛酮还原酶(aldo-ketoreductases，AKRs)催化还原N-乙基-甲基氨甲酰基苯乙酮(NEMCA)制备(S)-NEMCA-HEPE，并通过构建重组全细胞以及引入添加剂策略来提高AKRs催化该反应的

5、速率及转化率。针对不对称还原NEMCA生成(S)-NEMCA-HEPE这一反应，在NCBI数据库中搜索潜在的可催化该反应的酶源。最终选定枯草杆菌168(Bacillussubtilis168)基因组，并从中获得三种AKRs基因(ytbE，iolS，yhdN)，在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达，最佳诱导温度为25℃，IPTG终浓度0.1mM。蛋白经过镍柱纯化后得到纯的ytbE、iolS和yhdN酶，其比活力分别为0.6U/mg、2.4U/mg和0.5U/mg。对AKRs进行酶学性质研究，发现AKRs酶适合在30-40℃以及pH6.5-7.0这一2+中性或中性偏酸的磷酸缓冲液中发挥较好

6、的活性。此外，除了金属离子Ca和2+Mg对iolS和yhdN的酶活有微弱激活作用外，大部分金属离子均对AKRs活性2+3+产生不同程度的抑制作用，以重金属离子Cu和Fe对AKRs酶活抑制最为明显。将三种AKRs酶用于催化制备(S)-NEMCA-HEPE的反应中。从反应结果来看，不同的AKRs在不同辅因子存在时都可以催化NEMCA发生还原反应，得+到对映体过量值(e.e.p)为99.9%的(S)-NEMCA-HEPE。当NAD参与辅因子循环时，+iolS、ytbE和yhdN催化该反应的转化率分别为10.1%、15.3%和0.8%；而当NADP存在反应系统时，iolS、ytbE和yhdN催化

7、该反应得到的转化率分别为19.2%、18.4%和5.7%，可见三种AKRs在不同辅因子存在时表现出不同的催化活性，并++且都优先选择依赖辅因子NADP。在所有AKRs催化的反应中，iolS酶在NADP存在时催化反应的活性最佳，在24h内得到最高的转化率19.2%。为了研究不同AKRs催化该反应存在的差异，利用分子对接(moleculedocking)分析三种AKRs和底物NEMCA结合时产生的相互作用，发现AKRs中的氨基酸与NEM