Bacillus cereus中羰基还原酶的基因挖掘及克隆表达研究

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1、分类号０８１２学号２０１５２２７０３０３２学校代码１０４８８密级公开硕士学位论文Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ中羰基还原酶的基因挖掘及克隆表达研究学位申请人：阮涛学科专业：化学工程与技术指导教师：杨忠华教授答辩日期：２０１８年５月２０日ＡＤｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎＳｕｂｍｉｔｔｅｄｉｎＰａｒｔｉａｌＦｕｌｆｉｌｌｍｅｎｔｏｆｔｈｅＲｅｕｉｒｅｍｅｎｔｓｑｆｏｒｔｈｅＤｅｇｒｅｅｏｆＭａｓｔｅｒｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＧｅｎｅＭｉｎｉｎｇＣｌｏｎｉｎａ

2、ｎｄＥｘｒｅｓｓｉｏｎｏｆａ，ｇｐＣａｒｂｏｎｌＲｅｄｕｃｔａｓｅｆｒｏｍＢａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓｙＭａｓｔｅｒＣａｎｄｉｄａｔｅ：ＴａｏＲｕａｎＭａｏｒ：ＣｈｅｍｉｃａｌＥｎｉｎｅｅｒｉｎａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｊｇｇｇｙＳｕｐｅｒｖｉｓｏｒ：Ｐｒｏｆ．ＺｈｏｎｈｕａＹａｎｇｇＷｕｈａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＷｕｈａｎ，Ｈｕｂｅｉ４３００８１，Ｐ．Ｒ．ＣｈｉｎａＭａ２０１８ｙ，武汉科技大学研究生学位论文创新性

3、声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立进行研究所取得的成果。除了文中己经注明引用的内容或属合作研究共同完成的工作外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研宄做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。申请学位论文与资料若有不实之处一，本人承担切相关责任。论文作者签名：日期：研究生学位论文版权使用授权声明本论文的研宄成果归武汉科技大学所有，其研宄内容不得以其它单位的名义发表。本人完全了解武汉科技大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向有关

4、部门按照《武汉科技大学关于研（宄生学位论文收录工作的规定》执行）送交论文的复印件和电子版本，允许论文被查阅和借阅，同意学校将本论文的全部或部分内容编入学校认可的国家相关数据库进行检索和对外服务。论文作者签名：你热指导教师签名：摘要手性醇是工业合成药物一种、农用化学品、天然产品及某些特殊材料过程中重要的手性砌块。利用羰基还原酶不对称还原前手性羰基化合物，是合成手性醇一的重要方法之。本文通过构建基因挖掘策略，挖掘蛋白质数据库中潜在羰基还。原酶，并进行了克隆表达研究本研宄在确定羰基还原酶各家族的氨基酸保守序列

5、后，选取来源于极端嗜热菌中的羰基还原酶（ＡｐＣＲ），作为探针酶。以探针酶的氨基酸序列为模板，在蛋白质数据库中进行同源序列比对、筛选后，构建候选酶库。通过对候选酶序列和探针序列进行氨基酸序列比对、二级结构模拟比对、三级结构模拟比对后，确定来源于蜡样芽胞杆菌中的蛋白ＢｃＣＲ，与探针ＡＣＲ序列具有相似的二级、三级结构，并且都具有羰基还原酶ＳＤＲｓ家族的ｐＡＣＲ相似的酶学性质及功能。以５．ｃｅｒｅｉｗ氨基酸保守序列，推测该蛋白具有与ｐ的基因组ＤＮＡ为模板，ＰＣＲ克隆出ＢｃＣＲ基因（７３８ｂｐ，构建重组质粒ＥＴ）ｐ－ｃ／２

6、８ａＢＣＲ，并将其导入在五．ｃｏ／Ｂ１２１ＤＥ３ｌｙｓＳ中，实现了可溶性表达，蛋白（）ｐ大小约为３２ｋＤａ。°，其最适反应温度为５７，最适对表达出的目标酶进行酶学性质研究发现．５ＣＨ为°７，Ｃ范围内较稳定，未发现能明显促进该酶催化能力的反应ｐ．０该酶在４０＝ＢＥ的动力学参数Ｋ＝ｍｍｏ。ｍ．／Ｌ，．金属离子该酶对ＣＯ１８５ｌ最大反应速率Ｖｍａｘ０２２＿＿ｌ１ｍｏ＿ｍ＿Ｒ与ＡＨｌｉｎｍｇ。目标酶的这些酶学性质与基因挖掘过程中ＢｃＣｐＣＲ的比。利用重组菌的全细胞－对初步分析结果基本吻合，催化羰基化合物４氯乙酰乙酸乙酯ＣＯＢＥ

7、还原羰基还原酶的功能性鉴定，还原产物通过气相色谱进行（），进行°１３７检测。当底物浓度为２０ｍｍｏｌ／Ｌ、菌体浓度为０．ｇ／ｍＬ时，Ｃ反应２０ｈ后，ａ＞０－７，产物构型为产率达到６．７％。羰基还原的产物旋光值（Ｒ）ＣＨＢＥ。一本文构建了一种羰基还原酶的基因挖掘策略，利用该方法成功获得了种来。源于５．ｃｅｗｔｗ的新型羰基还原酶ＢｃＣＲ，为获取高效羰基还原酶提供基础研究，与传统的获取羰基还原酶的方法相比，基因挖掘显得更高效前景更广。关键词：手性醇；基因挖掘；羰基还原酶；原核表达；不对称还原ＩＡｂｓｔｒａｃｔＣｈｉ

8、ｒａｌａｌｃｏｈｏｌｉｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｃｈｉｒａｌｂｌｏｃｋｆｏｒｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｖａｒｉｏｕｓｃｈ