茶树无色花色素还原酶基因克隆及表达分析

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1、茶叶科学2010，30(1)：27～361竺竺竺!型!丝兰型竺竺茶树无色花色素还原酶基因克隆及表达分析马春雷，乔小燕，陈亮’(中国农业科学院茶叶研究所茶树资源与改良研究中心，国家茶树改良中心．浙江杭州310008)摘要：采用EST测序技术和YRACE技术，获得了茶树儿茶素代谢途径中的～个重要酶一无色花色素还原酶的全长基因，在GenBank的登录号为EF205148，序列全长l301bp，其中开放阅读框长l029bp，编码342个氨基酸，3’端有一个明显的多聚腺苷酸加尾信号，推测的蛋白分子量约为37．5kD，理论等电点为5．8

2、l。将该基因重组到表达载体pET-32a(+)qb进行原核表达，经IPTG诱导、SDS—PAGE检测，结果表明茶树无色花色素还原酶基因能在大肠杆菌BL21中表达，电泳检测到一条大约60kD的外源蛋白，与预测的融合蛋白分子量相符。同源性分析表明茶树无色花色素还原酶基因编码的氨基酸序列与其他植物具有较高的相似性，例如与亚洲棉、草莓和葡萄的相似性分别为70％、68％、71％。利用半定量PCR技术检测总儿茶素含量不同的4个茶树品种中与类黄酮合成相关的黄酮醇合成酶(FLS)、二氢黄酮醇．4．还原酶(DFR)、无色花色素还原酶(LAR)

3、、花色素合成酶(ANS)等7个基因的表达情况，结果表明DFR和LAR基因的表达量与茶树中总儿茶素含量呈一定的相关性，而其他基因则与其相关性不大。关键词：茶树；无色花色素还原酶；基因克隆；序列分析中图分类号：$571．1；Q523文献标识码：A文章编号：1000．369X(2010)01．027．10CloningandExpressionAnalysisofLeucoanthocyantinReducaseGeneofTeaPlant(Camelliasinensis)MAChun．1ei，QIAOXiao．yan，CHEN

4、Liang+(ResearchCenterforTeaGermplasmandImprovement，TeaResearchInstituteChineseAcademyofAgriculturalSciences／NationalCenterforTeaImprovement，Hangzhou310008，China)Abstract：Theleucoanthocyantinreducasegene(LAn)，whichwasanimportantfunctionalgeneofcatechinsbiosynthesisp

5、athway,wasclonedfromteaplantbyESTsequencingandrapidamplificationofeDNAends(RACE)．Thefull·lengthcDNAofLARis1301bp(GcnBankaccessionNo．EF205148)，containinga1029bpORFencodinga342aminoacidsprotein，andits3’untranslatedregionhasanobviouspolyadenylationsignal．Thededucedpro

6、teinmolecularweightwas37．5kDanditstheoreticalisoelectricpointwas5．81．ThegenewasthenconstructedintoexpressionvectorpET032“+)foroverexpressioninprokaryotiecells．TheSDS-PAGEshowedthatinducedbyIPTG,theleucoanthocyantinrcducaseproteinswasexpressedinEscherichiacoliBL2i，a

7、nditsmolecularweighwasfoundtobeabout60kDbycheckingwithSDS·PAGE．nearlyequaltothepredicted．ThededucedaminoacidsequenceofLARfromteaplantshowedhighidentitywiththatofotherplants，forinstance7l％，70％and68％withHtisvinifera，GossypiumarboretumandFragariaananassa，respectively．

8、Fourdifferentcatechincontentcultivarswereselectedfromourteagermplasmappraisaldatabasetoassaythegeneexpressionlevelofthesevengenes，flavonolsynthas