bacillus+sp.yx-1中温酸性α-淀粉酶分离纯化及基因克隆和表达的研究论文

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1、摘要a．淀粉酶(1，4．Q．D．葡萄糖苷水解酶，EC3．2．1．1)从淀粉糖链内部水解l，4．Q．D．葡萄糖苷键，开发筛选具有各种特性的仅．淀粉酶成为目前酶制剂研究领域的一个重要方向。中温酸性Q．淀粉酶以其中温和耐酸特性有广泛的应用领域，对于丰富淀粉酶品种具有重要实践价值。同时，认识和探寻微生物酶的耐酸特性和相关机理也有积极的理论意义。本文从筛选新酶的角度入手，从Bacillussp．YX一1菌株中分离纯化得到一种具有新催化功能的a．淀粉酶，并对该酶的酶学特征和结构基因的克隆与表达等分子酶工程内容进行了研究。针对实验室保

2、藏的一株编号为YX．1的淀粉酶产酶菌株(该菌株在pH4．5的固态培养基上表现出水解淀粉产透明圈的特性)进行菌体形态、生理牛化以及分子生物学16SrDNA序列的鉴定，初步命名为Bacillussp．YX．1。同时，通过比对分析发现该菌株16SrDNA序列与B．subtilis，B．1ichenifo删括，B．stearothermophilus以及B．amyloliquefaciens等常见的a．淀粉酶生产菌株16SrDNA序列没有高同源性，而与之同源性较高的其它芽孢杆菌属菌株(Bacillussp．)却没有相关产酶的报道

3、。从物种进化分析结果来看，Bacillussp．YX．1是一种与相关同源菌株存在分类差异的淀粉酶产酶新菌株。该菌株16SrDNA序列已在GenBank数据库登记，登记号为DQ883446。采用紫外诱变的方法针对Bacillussp．YX．1进行优良产酶菌株的选育，筛选得到一株突变菌株，产酶能力与原始菌株Bacillussp．YX．1相比有显著提高。通过培养基优化，跟踪突变菌株产酶过程，发现44h时达到产酶峰值162．24U／mL，是出发菌株产酶能力的3倍。对其粗酶酶学特性分析表明，与原始菌株产酶酶学性质相似。针对Baci

4、llussp．YX．1发酵粗酶进行了分离纯化，经硫酸铵分级沉淀、DEAE-SepharoseFastFlow阴离子层析、SephadexG．75凝胶过滤层析等步骤后获得电泳均一的淀粉酶，其酶蛋白的亚基分子量约为58kDa。纯化后比活由粗酶的17。9U／mg提高到607U／mg，纯化倍数为34倍。采用得到的纯酶对可溶性淀粉底物进行水解，并与商品化中温0【．淀粉酶比较发现，该酶是一个液化型水解内切酶。采用纯化得到的Bacillussp．YX．10【．淀粉酶，针对其主要酶学性质进行了研究。该酶最适反应pH为5．0，在pH4．5

5、．11．0范围内稳定，具有较好的耐酸特性和广泛的稳定性。该酶最适反应温度为40．50。C，在40．60*C范围内稳定。金属离子中，C一十对于酶活性没有显著的影响，Na+对酶活性有激活作用。Bacillussp．Yx．1Ⅱ．淀粉酶与商品化中温a．淀粉酶比较而言，在pH4．5．5．O的偏酸性条件下表现出较强的活性及稳定性；pH5．0时该酶对于多种生淀粉底物也有良好的水解作用；同时，对于15．20％的高浓度玉米生淀粉底物也都能够进行有效的水解。经LC．MASS．MASS分析得到了酶蛋白中两个肽段的氨基酸序列，通过比对发现，该酶

6、与NCBI中已报道的Gt．淀粉酶序列具有一定的同源性，同时，在氨基酸水平上也存在着差异。因此，该酶是一种具有研究价值和应用前景的中温酸性旺．淀粉酶。通过搜集NCBI数据库中芽孢杆菌属a．淀粉酶氨基酸序列，并根据序列的保守性和江南大学博士学位论文同源性设计引物，扩增获得Bacillussp．YX．1Q．淀粉酶的结构基[司amy。该基因全长1545bp，编码514个氨基酸残基。该基因已在GenBank数据库登记，登记号为EUl59580。将结构基因全序列口聊)，比对分析发现，Bacillussp．YX．1中温Q-淀粉酶与芽孢

7、杆菌属a-淀粉酶表现出较高的同源性，然而，在表观酶学性质上Bacillussp．YX-1中温0【-淀粉酶表现出较好的耐酸特性和较强的生淀粉底物水解能力。在研究中分别从酶蛋白氨基酸组成、维系酶结构稳定的空间作用力以及酶蛋白结构等多角度来阐述Bacillussp．YX一1中温洳淀粉酶基因序列与其催化功能(酸性条件下的活性和稳定性)之间的内在联系；并从基因序列角度初步分析了紫外诱变后突变菌株产酶能力提高的机理。将Bacillussp．YX．1中温(It．淀粉酶结构基因插入表达载体pET28a中并转化相应表达宿主EcoliBL2

8、1(DE3)中成功构建带有目的基因的重组菌株EcoliBL21(DE3)(pET-28a．amy)。当诱导培养温度从37℃降低至30。C时，表达后形成的可溶性蛋白增加，并确定诱导培养条件为：诱导培养温度30℃，诱导物IPTG浓度0．5mmol／L。在以上诱导培养条件下，该重组菌粗酶液催化活性为1．52U／mg。利用H