糖多孢红霉菌糖基转移酶突变体构建及其产物鉴定

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1、安徽大学硕士学位论文糖多孢红霉菌糖基转移酶突变体的构建及其产物鉴定姓名：许晓娟申请学位级别：硕士专业：生物化学与分子生物学指导教师：张部昌2010-04摘要糖多孢红霉菌糖基转移酶突变体的构建及其产物鉴定摘要红霉素（erythromycin）是一类应用于临床上的大环内酯类抗生素，由糖多孢红霉菌（Saccharopolysporaerythraea）发酵产生。它在保障人类健康方面发挥了重要作用，但令人困惑的是日益严重的耐药性问题。目前已经上市了化学半合成第三代红霉素，但是化学方法有步骤繁琐、引起环境污染等缺陷。探索基因工程方

2、法改造红霉素合成过程，可为新型抗生素的研发开辟新的途径。糖基是许多抗生素母环合成后添加的基团，是其发挥抑菌生物活性所必不可少的组分，也是影响生产菌自我保护等功能的结构基础。通过对糖基的改造可以合成新的代谢产物，而改变糖基转移酶又是改造糖基的主要途径之一。在红霉素合成过程中有两个糖基化过程，一个是大环C-3位上的糖基化，一个是C-5位上的糖基化。糖基转移酶EryBⅤ和EryCⅢ分别负责这两个糖基化反应。本文以这两个糖基转移酶为对象，利用同源重组的方法构建两个糖多孢红霉菌突变体，探索改造糖基结构、合成红霉素衍生物的基因工程新

3、途径。为了失活糖基转移酶EryBⅤ和EryCⅢ，本研究采取基因敲除的方法分别缺失它们的编码基因eryBⅤ、eryCⅢ。为了实现这一效果，分别设计删除这两个基因中130bp碱基得到失活的ΔeryBⅤ、ΔeryCⅢ片段，各在删除部分前后选择1000bp左右的片段进行扩增，形成突变基因的两个同源臂，克隆至pUC18质粒上构建pUC18-ΔeryBⅤ和pUC18-ΔeryCⅢ。鉴定后再将ΔeryBⅤ和ΔeryCⅢ亚克隆至同源重组型质粒pWHM3上，分别构建同源重组质粒pWHM3-ΔeryBⅤ和pWHM3-ΔeryCⅢ。接着将它们

4、分别导入糖多孢红霉菌A226原生质体中，经硫链丝菌肽抗性筛选出A226/pWHM3-ΔeryBⅤ和A226/pWHM3-ΔeryCⅢ整合体菌株各一株，对两者进行生物活性试验和薄层层析，显示质粒的整合均破坏了红霉I糖多孢红霉菌糖基转移酶突变体的构建及其产物鉴定素合成途径，红霉素A无法正常合成，由此鉴定出两者分别整合到糖多孢红霉菌红霉素合成基因位点。然后，根据pWHM3质粒在无抗环境下的不稳定性，通过抗性负筛的方法进行突变体菌株的筛选，挑取大量克隆检测后筛出1株缺失EryBⅤ酶活性和1株缺失EryCⅢ酶活性的糖多孢红霉菌，分

5、别命名为A226-ΔeryBⅤ和A226-ΔeryCⅢ。两个突变体的生物活性试验表明在分别缺失糖基转移酶EryBⅤ和EryCⅢ活性的情况下，它们的发酵产物对枯草芽孢杆菌都没有抑制作用；进一步的薄层层析结果显示A226-ΔeryBⅤ和A226-ΔeryCⅢ都不积累红霉素A；最后通过质谱分析发酵产物，对它们分子量大小的测定以及对比发现A226-ΔeryBⅤ积累红霉内酯B（EB），A226-ΔeryCⅢ积累3-L-mycarose-红霉内酯B（MEB）。随后，将eryBⅤ和eryCⅢ基因分别克隆至表达质粒pZMW上，导入对应的

6、突变体，结果恢复了突变菌株合成红霉素的能力。本论文成功构建了两个糖基转移酶突变体A226-ΔeryBⅤ和A226-ΔeryCⅢ，这为后续改造糖基结构，合成新的前体或新的红霉素衍生物铺平了道路。此外，两个糖基转移酶编码基因的正确克隆也为进一步研究其酶学特性，将它们应用到组合生物学中合成新物质打下了基础。关键词：糖多孢红霉菌；糖基转移酶；同源重组IIABSTRACTConstructionofglycosytransferasemutantsinSaccharopolysporaerythraeaandidentificat

7、ionoftheirProductsABSTRACTErythromycin,aclinicallyusefulmacrolideantibiotic,isproducedbySaccharopolysporaerythraea.Anincreasingproportionofpathogenicbacteriahavedevelopeddrugresistancetoerythromycinsforthelong-termuse.Thus,thereisagrowingneedtodevelopnewderivativ

8、esoferythromycintocombattheworseningproblemofantibioticresistanceamongpotentiallife-threateningpathogens.Thethirdgenerationoferythromycinwhichmodifiedbysemi-sy