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《药学毕业论文产红霉素c的糖多孢红霉菌a226g-突变体的构建》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、XX大学毕业论文产红霉素C的糖多抱红霉菌A226G.突变体的构建姓名：2014年6月25日产红霉素C的糖多范红霉菌A226G-突变体的构建作者：袁华黄训端张部昌刘道琴赵皓孔小卫张书祥【摘要】糖多抱红霉菌eryG基因编码产物为红霉素3-0甲基转移酶(EryG),失活eryG基因能阻断红霉素A的生物合成，积累其中间产物红霉素Co以糖多砲红霉菌A226基因组DNA为模版，用重叠PCR方法扩增岀eryG基因两侧约1600bpDNA片段(AG),其中去除了EryG上S腺苜甲硫氨酸结合区域对应的290bpDNA片段。将该片段克隆于质粒pWH
2、M3,构建了同源重组质粒pWHMAGoPEG介导原生质体转化法将pWHMAG转入糖多泡红霉菌A226屮,通过染色休同源重组突变染色体上eryG基因。利用薄层层析、PCR和质谱方法筛选出一株eryG基因突变的糖多抱红霉菌A226G■突变体，此突变体主耍积累屮间产物红霉素C而不再合成红霉素A。通过eryG基因的功能补偿，糖多抱红霉菌基因工程菌A226G・G+口J以恢复红霉索A的合成能力。【关键词】糖多他红霉菌；红霉素；3-0甲基转移酶；同源重组；功能补偿ABSTRACTSaccharopolysporaerythraeaerythr
3、omycin3"0methyltransferase(EryG),encodedbytheeryGgene,couldplayanimportantroleinerythromycinbiosynthesis,andtheinactivationoferyGgenewouldleadtoerythromycinCaccumulationintheeryGmutantfermentationculture.TakingSac.erythraeagenomicDNAasatemplate,about1,600bpDNAfragmen
4、twithdeletionofa290bpfragmentwhichcontainedSadenosylmethioninebindingdomainineryGgenewasamplifiedbyoverlapPCRandclonedintothevectorpWHM3toconstructhomologousrecombinationplasmidpWHMAG.ItwasthenintroducedintoSac.erythraeabyPEGmediation,andtwointegrants(IandII)weresele
5、cted.AfterintegrantIhadgrownforthreegenerationsonR3Mmediawithoutthiostrepton(Thio),theywereprotoplastedandplatedonR3MmediawithoutThio.Onemutant,A226G-,wasscreenedandidentifiedbyTLC,PCRandMSanalyzes.TheA226G-mutantaccumulatederythromycinCinsteadoferythromycinAinthecul
6、ture.ByintroducingcryGgeneexpressionvectorintoA226G・mutant,erythromycinAproductionwasrestored,buttheyieldwassomewhatlowerthanthatofitsparentstrainA226.KEYWORDSSaccharopolysporaerythraea;Erythromycin;3"Omcthyltransfcrasc;Homologousrecombination;Functioncompensation红霉素
7、(erythromycin,Er)是由革兰阳性细菌糖多抱红霉菌(Saccharopolysporaerythraea)合成的次生代谢产物，为一类人环内酯类抗生索，包括红霉素A(ErA)、红霉素B(ErB)、红霉素C(ErC)和红霉素D(ErD)等。这四种红霉素均有抑菌活性，但在临床上抑菌活性最高，用途最广泛的是ErA[1,2]。红霉素的生物合成分为两大部分：红霉素母核6脱氧红霉内酯B(6dEB)的合成和6dEB的后修饰。前者出1分子丙酰辅酶A和6分子甲基丙二酸单酰辅酶A在聚酮合成酶复合体(PKS)的催化作用下完成，其过程类似于饱
8、和脂肪酸的合成反应；随后6dEB在红霉素C6位疑基化酶及在C3位和C5位径基糖基化酶作用下形成了第一个冇活性的屮间产物ErD；ErD可以先在C12位轻基化酶EryK作用卜•形成ErC,再在3”O甲基转移酶EryG作用下形成ErA,还可以通过另一条次要途径，即Er
