利用eryk基因和eryg基因提高红霉素产量及糖多孢红霉菌sace_0012基因功能地研究

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1、独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安时或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：彳余．翻兰虽签字日期：沙肛年g月7日学位论文版权使用授权书泐钆踢(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：搿、嘶多氧签字日期：砂／>年／月7日学位论文作者毕业去向．I工作单位：通讯地址：导

2、师签名：签字日期：电话：邮编：摘要lIIIliIIIIIIIllIlllIIIY2321572放线茵次级代谢可产生多种生物活性物质，这些物质根据功能可分为抗生素、免疫抑制剂、抗病毒药物、抗肿瘤药物等，糖多孢红霉菌(Saccharopolysporaerythraea)次级代谢产生红霉素A(ERA)能有效抗呼吸道感染，是一类抗革兰氏阳性菌的广谱抗生素，因此提高红霉素A产量的研究具有重要的经济价值。次级代谢物的产生受到多种理化因素的影响，如前体供应、溶氧浓度、环境温度和酸碱度等。传统提高次级代谢物方法是通过随机诱变筛选高产菌株，随着

3、分子生物学技术的日渐成熟，利用代谢工程方法对生物合成途径进行遗传修饰，实现次级代谢物产量的提高。本研究通过增加红霉素生物合成基因eryK和eryG基因拷贝数，提高红霉素C12羟化酶(EryK)和红霉素"-O一甲基转移酶(EryG)的表达量，可以在一定程度上提高红霉素A的产量。当EryK和EryG基因拷贝数提高后，中间产物红霉素B(ErB)和红霉素C(ErC)积累量下降，红霉素D(ErD)可以最大化地转化为红霉素A(ERA)。研究表明在提高ErA产量的同时，也降低了ErB和ErC等杂质的含量，减少红霉素下游分离纯化过程以及由此引发

4、的环境问题。本研究首先提取糖多孢红霉菌A226总基因组，利用PCR技术获得eryK和eryG基因片段，在pUCl8基础上构建pUCKKG中间载体，以pUCKKG中间载体为基础构建了糖多孢红霉菌整合表达质粒pZMWKKG，利用PEG介导原生质体转化成功将pZMWKKG质粒导入红霉素工业菌株ZMD菌株中，获得ZMD／pZMWKKG工程菌株，其基因组中eryK和eryG基因拷贝数增加，对菌株ZMD／pZMWKKG的发酵产物进行分析，经过多次克隆的筛选，获得红霉素高产工业菌株。糖多孢红霉菌次级代谢产生红霉素，具有重要的医用价值，同时糖多

5、孢红霉菌生长周期中也有复杂的形态分化。糖多孢红霉菌生命周期开始于孢子的萌发，进而形成致密的基内菌丝，在一定环境压力下，由基内菌丝向外萌发形成气生菌丝，再萌发成孢子丝。目前关于对孢子有关的调控机制研究越来越热，本研究另一个内容就是研究糖多孢红霉菌中TetR家族转录调控子SACE0012基因对菌株利用eryK基因和eryG基因提高红霉素产量及糖多孢红霉菌SACE一0012基因功能的研究形态分化的影响，通过对SACE0012基因阻断观察突变体的孢子生长，并分别在SACE7040基因删除突变体和6坳基因删除突变体中阻断SACE0012基

6、因，探索SACE0012基因和SACE7040基因这两个基因的功能关系。研究主要采用线性片段同源重组技术构建了ASACE0012、AbldD／ASACE0012、ASACE7040／ASACE0012三个突变菌株，将这些突变菌株与糖多孢红霉菌A226、AbldD、△Is；ACE7040菌株同时接到R3M大斜面上30℃恒温培养，观察其孢子生长情况。结果显示ASACE0012突变体孢子生长比A226明显提前，推测SACE0012基因对糖多孢红霉菌的形态分化有一定的负调控作用。本实验室已经报道SACE7040基因对糖多孢红霉菌的形态分

7、化也具有负调控作用，为了进一步研究SACE0012和SACE7040基因之间的生物学关联，在ASACE一7040突变体中阻断SACE一0012基因观察孢子生长表型与ASACE一0012突变体一致，初步推测这两个基因作用靶点可能是上下游关系。因SACE7040基因靶点位于bldD基因靶点的下游，而在AbldD突变体中删除SACE0012基因发现不能恢复孢子的生长，推测SACE0012基因靶点可能位于bldD基因靶点的上游，这一结果进一步说明了SACE0012基因靶点可能位于SACE7040基因靶点的上游，从而阐明了这两个基因之间的

8、生物学关联，但具体的调控机制还有待于进一步的研究。本研究为提高红霉素产量以及理解糖多孢红霉菌形态分化调控机制奠定了一定的理论基础和实验基础。随着对结构基因和调控基因研究的不断深入，我们能够更准确快速地鉴定某些基因的功能，同时提高目的产物的产量，并在形态分化调控机