刺糖多孢菌eryR基因的克隆与功能研究.pdf

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1、分类号密级刺糖多孢菌eryR基因的克隆与功能研究CloningandfunctionalresearchoferyRgene^J1-I■Irom6'accttaropotvsporaspmosa指导教师姓名、职称夏皇丛塾撞湖南师范大学学位评定委员会办公室二零一一年六月≯。摘要eryR基因是红色糖多孢菌(Saccharopolysporaerythraea)茵体形态分化和红霉素合成的途径专一调控基因，该基因缺失的突变株，其红霉素产量仅为原始菌株的1／7，并且形态分化也受到明显的抑制。过量表达eryR基因，导致红霉素的产量提高20％。eryR蛋白是ery基因簇一个共同的转录调控因子，它能够与

2、整个ery基因簇的启动子结合，增强转录起始效率，从而调控ery基因簇的表达，提高红霉素的产量。因此，我们尝试在和红色糖多孢菌亲缘关系较近的刺糖多孢菌中，获得和eryR基因功能相类似的调控基因。本论文利用PCR扩增了刺糖多孢菌(Saccharopolysporaspinosa)XSP01103中489bp的eryR-s基因，并将eryR-s基因以正确的读码框架克隆到大肠杆菌(Escherichiacoli)表达载体pET28a(+)T7启动子下游的NdeI和XbaI位点之间，转化E．coliBL21(DE3)，0．8mMIPTG诱导表达了20kDa大小的重组蛋白。eryR．S蛋白质谱鉴定结

3、果显示，该蛋白与来源于红色糖多孢菌的eryR蛋白是同源蛋白，是一个潜在的转录调控因子(putativetranscriptionalregulator)。本研究选用本研究室构建的大肠杆菌．链霉菌穿梭表达载体pMF，将来自刺糖多孢菌的eryR-s基因通过NdeI／XbaI酶切位点克隆至pMF的actff-ORF4／Pact，启动元件下游，通过接合转移试验转入天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)M145和变铅青链霉菌(Streptomyceslividans)TK24中。对两组原始菌株和各自的转化子进行固体平板培养和液体摇瓶发酵培养，观察菌体形态，并测定次生代谢产物放

4、线紫红素的产量。试验结果发现，接合子M145／pMF．eryR-s的Act摇瓶发酵产量是对照株M145的3．43倍，接合子TK24／pMF．eryR．s的Act摇瓶发酵产量是对照株TK24的69倍，而对照菌株M145和M145／pMF、TK24和TK24／pMF之间并没有很大差别。接种R4C固体培养基，观察色素和孢子形成情况，发现转化子M145／pMF．eryR-s和TK24／pMF—eryR-s的孢子形成受到了明显的抑制，并且色素形成的起始时间比两株对照菌都要早。本研究首次从刺糖多孢菌中克隆了一个潜在的调控基因eryR-s，并且在模式菌株天蓝色链霉菌和变铅青链霉菌中进行了初步的功能研究

5、，为在刺糖多孢菌中的后续研究工作奠定了基础。关键词：刺糖多孢菌；eryR；放线紫红素；异源表达；接合转移HABSTRACT‘EryRgeneisapathway-specificregulatorygeneofSaccharopolysporaerythraea，regulatingthemorphologicaldifferentiationandsynthesisoferythromycin．DeletionofEryRin&erythraeadecreasedtheerythromycintiterinaliquidculture7．foldandblockeddifferenti

6、ationonasolidmedium．OverexpressionoferyRgeneleadedtoallimprovementoferythromycinproductionby20％．EryRproteinisatranscriptionalregulator,whichcanbindtothepromotersoftheerythromycinbiosyntheticgenecluster,enhancetheirtranscriptionandimprovetheerythromycinproduction．Sowetriedtogetasimilartranscriptio

7、nalregulatorinSaccharopolysporaspinosa，whichhasacloserelationshipwithS．erythraea．Inthispaper,the489bperyR-sgeneWasfirstamplifiedbyPCRfromSaccharopolysporaspinosa．TheeryR-sgenePCRproductWascloneddownstreamofpromoterPT7o