核糖体工程技术在刺糖多孢菌上的初步应用

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1、福建农林大学硕士学位论文核糖体工程技术在刺糖多孢菌上的初步应用姓名：陈丽仙申请学位级别：硕士专业：生物化学与分子生物学指导教师：关雄;黄天培20100501福建农林大学硕：t学位论文摘要多杀菌素，又名多杀霉素(Spinosad)，是由刺糖多孢菌(Saccharopolysporaspinosa)进行有氧发酵产生的产于细胞内的次级代谢产物，具有较高的杀虫活性、对非靶标动物不起作用和杀虫作用机理不同寻常等生物学特性，在防治田间虫害和储粮虫害上具有广阔的市场前景和良好的应用价值。本文根据核糖体工程理论，利用药物抗性突变技术筛选多杀菌素高产菌株，这是核糖体工程技术首次在糖多

2、孢菌属中的应用，不仅为今后核糖体技术在其他种属微生物的应用奠定了研究基础，也为多杀菌素高产菌株的选育开辟了一条新的、有效的途径。本文通过核糖体工程技术诱交选育多杀菌素突变株，主要结论如下：1、最小抑菌浓度的测定。在试验中发现刺糖多孢菌在含链霉菌40lag／mL时生长受到抑制，所以其最小抑制浓度为40lig／mL。2、建立了连续抗性筛选培养法，并通过高效液相色谱分析法发现其中一株链霉素抗性突变株的发酵产物中存在两个与多杀菌素组分A和D不一样的组分。3、新物质的分离提纯。通过大孔树脂吸附，硅胶层析和制备色谱等一系列方法对其中一种新物质进行分离提纯，得到其中一个组分含量在

3、99．6％的白色粉末。4、新物质的结构鉴定。通过红外、NMR、质谱对新物质进行结构鉴定，确定新物质的分子式为C33H5009，分子量为590．74，在结构上与多杀菌素系列物相比在四核环部分上缺少了福乐胺糖(forosamine)的组分，可能与己知的多杀菌素系列物在杀虫活性、生物合成机制和代谢调控途径存在差异。5、对剌糖多孢菌的抗性突变株进行DNA序列分析，发现了在第128位的A突变为G，由赖氨酸(AAG)突变为精氨酸(AGG)，第341位的G突变为A，由精氨酸(CGC)突变为组氨酸(CAC)，这些突变点位于rpsL基因(编码核糖体S12蛋白)的链霉素敏感域。已知rp

4、sL基因通过增加翻译因子来提高蛋白质的翻译活性，进而活化次级代谢调控。rpsL基因上的点突变与刺糖多孢菌链霉素抗性突变株产生的两种新物质是否有直接联系有待进一步的研究。关键词：多杀菌素；刺糖多孢菌；新物质；分离提纯；结构鉴定1福建农林大学硕士学位论文AbstractSpinosadisakindofsecondarymetaboliteofaerobicfermentationofSaccharopolysporaspinosa，withbiologicalcharacteristicsofhighinsecticidalactivity，nodamagetonon

5、-targetsandunusualmechanismofkillingpestsandSOOILIthasawidemarketprospectsinbiocontrolofinsectsinagricultureandgrain-store．Accordingtoribosomeengineering，weappliedchemoresistancemutationmethodtoscreenSpinosad—likeproductsof&spinosa．Sofar，ribosomeengineeringWasfirstusedinSspinosa，whichm

6、eansthatribosomeengineeringnotonlylaidresearchfoundationforitsapplicationinotherkindsofmicrobes．butcreatedanewandeffectivepathwaytoscreenstainswithhighlyproductiveSpinosad．Ourworkobtainedherewasasfollows：1．＆spinosagrowthwasinhibitedinthemediumcontaining40Ug／mLStreptomyces，indicatingthe

7、minimalinhibitoryconcentration(MIC)was40lag／mL．2．Wehadestablishedacontinuousresistancescreeningmethod．AndtwonewcomponentsdifferentformSpinosadAandDweredetectedfromaStreptomycesresistencemutantofS．spinosawtihHPLC．3．Topuri匆oneofnewcomponents，wehadusedkindsofmethods，includingmacroporous