产红霉素c的糖多孢红霉菌a226g

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1、产红霉素C的糖多孢红霉菌A226G作者：袁华黄训端张部昌刘道琴赵皓孔小卫张书祥【摘要】糖多孢红霉菌eryG基因编码产物为红霉素3"O甲基转移酶(EryG)，失活eryG基因能阻断红霉素A的生物合成，积累其中间产物红霉素C。以糖多孢红霉菌A226基因组DNA为模版，用重叠PCR方法扩增出eryG基因两侧约1600bpDNA片段(ΔG)，其中去除了EryG上S腺苷甲硫氨酸结合区域对应的290bpDNA片段。将该片段克隆于质粒p3，构建了同源重组质粒pΔG。PEG介导原生质体转化法将pΔG转入糖多孢红霉菌A226中，通

2、过染色体同源重组突变染色体上eryG基因。利用薄层层析、PCR和质谱方法筛选出一株eryG基因突变的糖多孢红霉菌A226G-突变体，此突变体主要积累中间产物红霉素C而不再合成红霉素A。通过eryG基因的功能补偿，糖多孢红霉菌基因工程菌A226G-G+可以恢复红霉素A的合成能力。【关键词】糖多孢红霉菌；红霉素；3"O甲基转移酶；同源重组；功能补偿ABSTRACTSaccharopolysporaerythraeaerythromycin3"Omethyltransferase(EryG),encodedbythe

3、eryGgene,couldplayanimportantroleinerythromycinbiosynthesis,andtheinactivationoferyGgeneycinCaccumulationintheeryGmutantfermentationculture.TakingSac.erythraeagenomicDNAasatemplate,about1,600bpDNAfragmententethioninebindingdomainineryGgeneplifiedbyoverlapPCRandc

4、lonedintothevectorp3toconstructhomologousrebinationplasmidpΔG.Itediation,andtediaediautant,A226G-,utantaccumulatederythromycinCinsteadoferythromycinAintheculture.ByintroducingeryGgeneexpressionvectorintoA226G-mutant,erythromycinAproductioneycin;3"Omethyltransf

5、erase;Homologousrebination;Functionpensation红霉素(erythromycin，Er)是由革兰阳性细菌糖多孢红霉菌(Saccharopolysporaerythraea)合成的次生代谢产物，为一类大环内酯类抗生素，包括红霉素A(ErA)、红霉素B(ErB)、红霉素C(ErC)和红霉素D(ErD)等。这四种红霉素均有抑菌活性，但在临床上抑菌活性最高，用途最广泛的是ErA［1，2］。红霉素的生物合成分为两大部分：红霉素母核6脱氧红霉内酯B(6dEB)的合成和6dEB的后修饰。

6、前者由1分子丙酰辅酶A和6分子甲基丙二酸单酰辅酶A在聚酮合成酶复合体(PKS)的催化作用下完成，其过程类似于饱和脂肪酸的合成反应；随后6dEB在红霉素C6位羟基化酶及在C3位和C5位羟基糖基化酶作用下形成了第一个有活性的中间产物ErD；ErD可以先在C12位羟基化酶EryK作用下形成ErC，再在3"O甲基转移酶EryG作用下形成ErA，还可以通过另一条次要途径，即ErD先在EryG作用下形成ErB，再在EryK作用下形成ErA［1，2］。红霉素生物合成的基因以单一拷贝、成簇形式存在于糖多孢红霉菌的环形染色

7、体上，质粒不参与红霉素的生物合成［1，3］。糖多孢红霉菌红霉素EryG是一种S腺苷甲硫氨酸(SAM)依赖性甲基化酶，在ErA生物合成过程中对中间产物ErC和ErD进行甲基化修饰，在降低红霉素的毒性和提高红霉素的活性方面起着重要的作用［1～4］。利用基因敲除技术阻断EryG编码基因(eryG)功能可以积累ErA生物合成的中间产物ErC。本研究构建了红霉素eryG基因失活的糖多孢红霉菌突变体A226G-，为进一步研究EryG与其底物(SAM、ErC和ErD)的定量关系以及EryG的其它相关酶学性质奠定了基础。1材料与方法

8、1.1材料(1)菌种和质粒糖多孢红霉菌A226、大肠埃希菌ET12567［5］和同源重组质粒p3［6］由中国医学科学院医药生物技术研究所王以光教授惠赠；糖多孢红霉菌染色体整合型表达载体pZMΔG、糖多孢红霉菌突变体A226G-、质粒pZMarker(DL2000和DL15000)为大连宝生物公司产品，RNaseA、dNTP、pfu